一种硝基呋喃类代谢物快速检测的前处理方法及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种硝基呋喃类代谢物快速检测的前处理方法及其检测方法。该方法包括如下步骤：1)在搅碎的动物组织中依次加入酸溶液和衍生试剂，得溶液A；2)将溶液A加热后加入萃取剂进行萃取，得上清液；3)在上清液中依次加入极性范围为0～3.5的有机溶剂和缓冲溶液，取下层检测液进行检测。本发明专利技术在加入萃取剂进行萃取后，仅通过加入有机溶剂，不仅能有效去除乙酸乙酯，同时还能将样品中多余的油脂去除干净，使得待检测的物质直接溶解在缓冲溶液中，简单高效，无需额外的仪器，大大简化了操作步骤，节约了仪器成本，提高了现场检测的操作性，同时也显著缩短了前处理的时间，实现了硝基呋喃类代谢物的现场快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种硝基呋喃类代谢物快速检测的前处理方法及其检测方法
本专利技术涉及硝基呋喃类代谢物检测领域，尤其涉及一种硝基呋喃类代谢物快速检测的前处理方法及其检测方法。
技术介绍
硝基呋喃类药物是一类人工合成的具有5-硝基呋喃环的广谱抗生素，常见的有以下4种：呋喃唑酮(AOZ)、呋喃它酮(AMOZ)、呋喃西林(SEM)和呋喃妥因(AHD)。我国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定在动物源性食品中不得检出硝基呋喃类代谢物，美国、日本、韩国和欧盟等国家同样规定在动物源性食品中不得检出。但到目前为止，仍有水产品检出硝基呋喃类药物及其代谢物的报道。这不仅危害人类身体健康，也影响水产养殖业的健康发展，同时给国家水产品出口带来巨大经济损失。国内外报道硝基呋喃类代谢物残留检测的方法主要有液相色谱-质谱法、液相色谱-紫外法、液相色谱-串联质谱法、酶联免疫法等，上述仪器法前处理复杂、繁琐、成本高、操作技术要求高。基于胶体金免疫层析技术的快速诊断试纸条(简称胶体金试纸条)，已逐渐应用于食品安全监督、生物医学、动植物检疫等领域，与仪器法相比，其具有更为简便快速、无需检测仪器，且成本低、无污染的优点，也逐渐应用于食品中农兽药残留检测中。原国家食品药品监督管理总局2017年第58号公告发布了“水产品中硝基呋喃类代谢物的快速检测胶体金免疫层析法(KJ201705)”，该方法中对硝基呋喃类代谢物的前处理采用了以下两种方法：方法一(液液萃取法)：称取2g±0.05g均质组织样品于50mL离心管中，依次加入4mL去离子水、5mL1mol/L盐酸和0.2mL10mmol/L邻硝基苯甲醛溶液，充分振荡3min；将上述离心管在60℃水浴下孵育60min；依次加入5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液、0.4mL1mol/L氢氧化钠溶液，6mL乙酸乙酯，充分混合3min，在室温(20～25℃)下4000r/min离心5min；移取离心后的上层液体3mL于5mL离心管中，60℃下氮气/空气吹干；向吹干的离心管中加入2mL正己烷，振荡1min，然后加入0.5mL10mmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液，充分混匀30s，室温下4000r/min离心3min(或静置至明显分层)；下层溶液即为待测液。方法二(固相萃取法)：取6g±0.05g均质组织样品于50mL离心管中，依次加入4mL去离子水、5mL1mol/L盐酸和0.2mL10mmol/L邻硝基苯甲醛溶液，充分振荡3min；将上述离心管在60℃水浴下孵育60min；依次加入5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液、0.4mL1mol/L氢氧化钠溶液、6mL乙酸乙酯，充分混合3min，在室温(20～25℃)下4000r/min离心5min；移取离心后的上层液体3mL于15mL离心管中，加入10mL10％乙酸乙酯-乙醇溶液，上下颠倒混合4～5次，4000r/min离心1min(底部会有部分沉淀)；连接好固相萃取装置，并在固相萃取柱上方连接30mL注射器针筒，将上述上清液全部倒入30mL针筒中，用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使注射器中的液体全部流过固相萃取柱，再重复推压注射器活塞2次，以尽可能将固相萃取柱中的溶液去除干净。将固相萃取柱下方的接液管更换为洁净的离心管，再向固相萃取柱中加1mL10mmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液。用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使固相萃取柱中的液体全部流至离心管中后，离心管中的液体即为待测液。而CN107677524A公开了一种含有硝基呋喃代谢物的动物源性样品测定的前处理方法，包括如下步骤：S01、在待测样品中加入疏散剂，研磨混合均匀，填入ASE加速溶剂萃取仪的萃取池；S02、在填充有待测样品和疏散剂的萃取池中，分别先后加入衍生化试剂与内标溶液，得到待提取样品；S03、在所述的待提取样品中加入水解衍生剂，得到待萃取液；S04、在得到的所述待萃取液中，加入乙酸乙酯或乙腈试剂，萃取，取上清液；S05、将所述上清液旋蒸至干，得到干渣；S06、所述干渣采用甲醇-甲酸水溶液复溶，且定容至1ml，过滤膜，得到液体待检测物；CN101949897A公开了一种硝基呋喃类代谢物前处理检测方法，包括如下步骤：1)样品取样；2)将样品与提取剂混合均匀并获取上清液；3)加入提取剂重新提取并获得混合提取液；4)在混合提取液之中加入衍生化试剂以及催化剂并混合均匀；5)将所述混合液冷至室温；6)将混合后的提取液调节到中性，并加入乙酸乙酯进行萃取；7)重复操作后，合并乙酸乙酯层；8)将其旋转蒸发至干并加入甲醇溶液溶解残渣；9)激活净化柱将甲醇溶解液过柱并获取洗脱液吹干；10)残留物加入乙腈水溶液以及异辛烷溶解并获取下层乙腈水层；11)将上述乙腈水层过微孔滤膜；12)分析并测定硝基呋喃类代谢物的成分以及含量。吴明媛等[1]公开了水产品组织中硝基呋喃类代谢物残留检测方法优化研究，其中公开了其前处理步骤为：称取2g均质后的样品于50mL离心管中，加入50uL混合内标工作液，加入5mL0.3mol/L盐酸溶液和150uL0.05mol/L2-硝基苯甲醛，混匀后置于恒温振荡器中37℃避光振荡16h。取出离心管避光冷却至室温，加入4mLpH调节剂(1M磷酸氢二钾：1M氢氧化钠＝1：3)调节pH至7～7.5，混匀后加入8mL乙酸乙酯，振荡5min，4000r/min离心5min。取4mL上清液至5mL玻璃管中，50℃下氮吹至干，用5％甲醇溶液1mL旋涡混合溶解残留物后，如油脂过多可4000r/min离心10min，下层液体过0.22μm滤膜，待分析。成强等[2]公开了超高压液相色谱-串联质谱测定渔业养殖环境中硝基呋喃代谢物，其中的前处理步骤为：1)衍生化：养殖水和底泥预先除去杂质，底泥在阴凉处自然风干，磨碎过20目筛，分别准确量取10mL水和称取2g底泥加入50mL离心管中，加入100μL混合内标物，涡旋1min。再加入5mL盐酸溶液和300μL2-硝基苯甲醛溶液，涡旋1min，充分混合均匀，置于恒温水浴振荡器中，避光水浴振荡，分别设置37、50、60和80℃，4种水浴温度，振荡时间分别设置为1、2、4、8和16h，其中37℃下仅设置振荡16h；2)提取与净化：取出离心管冷却至室温，加入适量(约8～10mL)磷酸二氢钾溶液，混合均匀，调节pH至7，加入10mL乙酸乙酯，涡旋2min后，6000r/min离心5min,，取上层乙酸乙酯，然后重复提取1次，合并上层乙酸乙酯在40℃下氮吹至干，使用1mL初始流动相定容，过0.2μm有机滤膜后待测。由上可知：现有的硝基呋喃类代谢物检测的前处理步骤中，加入萃取剂(乙酸乙酯)萃取后需配套氮吹仪或固相萃取等仪器去除乙酸乙酯，这些仪器不适于随身携带，不适于现场操作，并且当样品中的油脂过多时还需再加入有机溶剂去除油脂，费时费力，因而，如何对硝基呋喃类代谢物的前处理步骤进行改进，使之更为简单快捷，符合现场快速检测的标准仍然具有一定的挑战性。参考文献：[1]吴明媛等,水产品组织中硝基呋喃类代谢物残留检测方法优化研究[J],西南农业学报,2016,29(7)1750-1754.[2]成强等,超高压液相色谱-串联质谱测定渔业养殖环境中硝基呋喃代谢物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种硝基呋喃类代谢物快速检测的前处理方法，其特征在于：包括如下步骤：1)在搅碎的动物组织中依次加入酸溶液和衍生试剂，得溶液A；2)将溶液A加热后加入萃取剂进行萃取，得上清液；3)在上清液中依次加入极性范围为0～3.5的有机溶剂和缓冲溶液，取下层检测液进行检测；其中，步骤1)中所述衍生试剂选自2‑硝基苯甲醛、2‑氯苯甲醛、吡啶‑3‑羰基甲醛中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.一种硝基呋喃类代谢物快速检测的前处理方法，其特征在于：包括如下步骤：1)在搅碎的动物组织中依次加入酸溶液和衍生试剂，得溶液A；2)将溶液A加热后加入萃取剂进行萃取，得上清液；3)在上清液中依次加入极性范围为0～3.5的有机溶剂和缓冲溶液，取下层检测液进行检测；其中，步骤1)中所述衍生试剂选自2-硝基苯甲醛、2-氯苯甲醛、吡啶-3-羰基甲醛中的至少一种。2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于：所述溶液A的pH＝0～2.0。3.根据权利要求2所述的前处理方法，其特征在于：所述溶液A的pH＝0～1。4.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于：所述溶液A中衍生试剂的质量百分浓度为0.5～3‰。5.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于：步骤2)中的加热温度为60～85℃，加热时间为10～20min。6.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢俊平，李涛，伍志权，李慧琴，彭程，
申请(专利权)人：广州食源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44