一种芍药地下根茎的石蜡切片制作方法技术

本发明专利技术涉及一种芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，包括如下步骤：1)截取芍药的根茎，将其固定和软化；2)将所述根茎组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与展片、脱蜡、染色及封片。本发明专利技术的芍药地下根茎石蜡切片制作方法可切出结构完整、清晰的芍药地下根茎组织结构，可为芍药地下根茎开发利用及发育研究提供可靠的基础技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种芍药地下根茎的石蜡切片制作方法
本专利技术涉及芍药地下根茎显微组织切片观察
，具体涉及一种芍药地下根茎的石蜡切片制作方法。
技术介绍
芍药(Paeonialactiflora)为芍药科芍药属多年生宿根草本花卉，是我国的一种重要传统名花，具有重要的药用和观赏价值，备受我国和世界人民的喜爱。芍药的根茎是茎的变态短缩结构，是向上可以发芽，向下可以生根的结构，是芍药进行无性分株繁殖的基础，其生长发育的好坏直接决定了芍药的生长状况。了解根茎的发育和形成规律对芍药发育生物学基础研究及产业扩繁生产实践具有重要意义，目前对芍药根茎的研究少有报道。石蜡切片技术是开展植物发育生物学及组织化学研究的基础技术方法，其基本步骤包括样品的取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、脱蜡、染色和封片等一系列操作步骤，其中的每一个步骤对制成高质量的切片均十分重要，需要针对不同植物植株组织结构及同一植物不同组织部位和不同发育时期进行摸索，如能找到一种植物组织不同发育时期、不同品种间通用的组织切片方法，必将极大地促进与之相关研究的发展。在芍药中，此前的组织切片研究主要围绕芍药的地下芽、地上茎与地下根，且技术繁杂不统一，而对地下根茎特别是多年生根茎的石蜡组织切片研究很少涉及，同时，芍药不同品种群品种地下根茎生长、发育状况差异较大，木质部、形成层和韧皮部等组织软硬程度不一，目前对其形成发育规律缺乏必要的了解，因此，专利技术一种可靠通用的芍药根茎石蜡组织切片制作方法很有必要。综上所述,如果能找到芍药地下根茎的石蜡切片的通用制备方法,能为芍药根茎发育相关的显微组织学研究提供基础技术支撑，对揭示芍药根茎发育调控机理研究及开发利用具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对芍药不同品种群品种、不同生长年限地下根茎木质部、形成层、韧皮部三者硬度不一而导致切片过程中组织结构撕裂、易碎等技术问题，找到一种操作简易且通用的芍药地下根茎组织石蜡切片制备方法，使制作的切片组织结构完整、清晰，易于观察。为实现上述目的，一种芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获取芍药发育正常的地下根茎，将其固定和软化；(2)将所述根茎组织经脱水、透明、浸蜡与包埋、切片与展片、脱蜡、染色及封片，即得。本专利技术提供了完整的芍药地下根茎组织的石蜡切片制作的具体流程，利用该方法能获得结构完整、清晰的组织切片，切片结果稳定、可靠，为芍药根茎发育相关基础科学研究及开发利用提供了一种参考方法。在上述技术方案中，步骤(1)中，所述芍药地下根茎的获取，具体为：用不锈钢叉在距芍药茎秆基部15cm左右的位置垂直地面向下起挖，挖深15-20cm，在土球松动后，于另一侧在距芍药茎秆基部15cm左右的位置垂直地面向下起挖，挖深15-20cm，保证能将根茎全部挖出而不损伤根茎。将土球外围的大块土层去除后将其搬运至阴凉处自然晾晒10-20min后，手提茎秆基部，将根茎上剩余的土小心抖落，保证根茎全部露出，利于后续切割操作。用美工刀沿根茎横轴方向将根茎切下，去除多余的肉质根，用不锈钢双面刀片(使用时将其对折成两半，用其中任意一半进行切割)沿根茎横轴将根茎切割成厚约0.2mm的薄片，迅速放入装有FAA固定液(50％乙醇：冰醋酸：甲醛＝90:5:5，体积比)的离心管中浸泡保存带至实验室备用，不锈钢双面刀片韧性好、强度大，且质薄均匀，可以保证所切割根茎质地均匀、完整，迅速放入固定液中保存可防止切割下来的根茎薄片与空气接触而导致褐化。优选地，在上述技术方案中，步骤(1)中所述地下根茎发育正常，具体为：根茎组织结构完好、色泽鲜艳、无明显病虫害。进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(1)中所述将根茎固定，具体为：将离心管中的FAA溶液倒除后加入等体积的FAA试剂，以去除试剂中的泥土等杂质，抽真空后常温固定保存24h以上，抽真空有利于加速组织内的空气排出及FAA固定液向组织内渗透的过程，缩短固定时间。又进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(1)中所述将根茎软化，具体为：固定处理完毕后，向离心管中加入五分之一FAA体积的甘油，手动颠倒混匀，抽真空后常温软化处理10d以上备用，加入甘油有利于防止芍药根茎因木质部、形成层及韧皮部等因软硬程度不一而导致切片过程中组织碎裂，抽真空可以加速具有软化作用的甘油较快地渗入组织内，缩短软化时间。再进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(2)中，将根茎组织脱水，具体为：将软化处理完毕的材料中的FAA试剂倒除，先后依次加入等体积的浓度50％乙醇、浓度70％乙醇、浓度85％乙醇、浓度95％乙醇进行梯度脱水，各梯度间隔为1.5h。随后，倒除95％乙醇，加入等体积无水乙醇浸泡处理1.5h,更换无水乙醇再浸泡处理1.5h,梯度脱水可以保证根茎组织脱水彻底，利于后续操作。又进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(2)中，所述透明，具体为：脱水完成后，加入等体积的体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液浸泡处理2h，然后更换纯二甲苯浸泡2h，再次更换纯二甲苯浸泡处理2h，梯度透明可以保证根茎组织中乙醇完全排出，透明彻底，利于后续操作。进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(2)中，所述浸蜡和包埋，具体为：将熔点为60℃的固体石蜡在烘箱中融化成蜡液，待材料透明完成后，加入等体积的体积比为1:1的二甲苯和石蜡混合液，60℃烘箱中保温处理4h以上，之后将混合液倒除，加入等体积的纯石蜡液，60℃烘箱中保温浸蜡，每隔4h以上更换一次纯蜡液，重复3-4次后进行常规石蜡包埋，以保证组织中二甲苯被置换干净，确保浸蜡质量。包埋时将根茎组织横截面朝上水平放置在包埋盒的中间，保证根茎纵轴与包埋盒边缘留有2mm以上的间距，以保证根茎组织完整包于石蜡中，防止材料边缘石蜡过少而影响切片。将根茎组织横截面朝上摆放有利于调整材料在包埋盒中的位置，减少包埋所需时间。又进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(2)中，所述切片，具体为：根据根茎组织在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成矩形，以保证在切片时蜡带平直而不弯曲。将蜡块粘上方形木制蜡台，保证根茎横截面与木质蜡台粘贴面平行，将蜡台安装到旋转式手动切片机上进行切片，切片厚度16-25μm，以保证蜡带结构连续且完整。又进一步优选地，在上述技术方案中，步骤(2)中，所述粘片及展片，具体为：用回形针制作“L”型粘蜡钩，粘蜡钩的短边长约3cm，以使其尽量与载玻片宽度基本一致，利于后续操作。将粘蜡钩的长边固定于直径约为0.5cm的圆柱形竹签上。在干净的载玻片上用塑料滴管滴约20-50ul粘片剂(1g明胶+100ml蒸馏水+15ml甘油+1g苯酚，60℃加热溶解)，用戴乳胶手套的右手食指将其抹匀，使其覆盖整个载玻片的光滑面，加入约500ul蒸馏水。用钩的短边将载玻片上的水涂抹均匀，并将载玻片上的杂质去除后用其将蜡带粘至载玻片上，再加入约500ul蒸馏水，使蜡带充分伸展，将载玻片倾斜30°，将多余的水分用吸水纸吸收后，将载玻片置于组织烤片机上，设置温度42℃使蜡带伸展，烤片时间约20-30min,之后自然干燥，保存备用。用“L”型粘蜡钩的短边涂抹载玻片一方面可以将上面的多余的水和杂质去除，另一方面可以利用其粘有的水分方便地将蜡带粘起移动至载玻片上。再进一步优选地，在上述技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获取芍药的地下根茎，将其固定和软化；(2)将所述根茎组织经脱水、透明、浸蜡与包埋、切片与展片、脱蜡、染色及封片，即得。

【技术特征摘要】
1.一种芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获取芍药的地下根茎，将其固定和软化；(2)将所述根茎组织经脱水、透明、浸蜡与包埋、切片与展片、脱蜡、染色及封片，即得。2.根据权利要求1所述的芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(1)中所述根茎的获取，具体为：用不锈钢叉在距芍药茎秆基部15cm左右的位置垂直地面向下起挖，挖深15-20cm，在土球松动后，于另一侧在距芍药茎秆基部15cm左右的位置垂直地面向下起挖，挖深15-20cm，将土球外围的大块土层去除后将其搬运至阴凉处自然晾晒10-20min后，手提茎秆基部，将根茎上剩余的土小心抖落，用美工刀沿根茎横轴方向将根茎切下，去除多余的肉质根，用不锈钢双面刀片沿根茎横轴将根茎切割成约0.2mm的薄片，迅速放入装有FAA固定液(50％乙醇：冰醋酸：甲醛＝90:5:5，体积比)的离心管中浸泡保存带至实验室备用。3.根据权利要求1-2所述的芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(1)中，所述将根茎进行固定和软化，具体为：将离心管中的FAA溶液倒除后加入等体积的FAA试剂，以去除试剂中的泥土等杂质，抽真空后常温固定保存24h以上，随后向离心管中加入五分之一FAA体积的甘油，手动颠倒混匀，抽真空后常温软化处理10d以上备用。4.根据权利要求1-3所述的芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(2)中，所述根茎组织脱水，具体为：将软化处理完毕的材料中的FAA试剂倒除，先后依次加入等体积的浓度50％乙醇、浓度70％乙醇、浓度85％乙醇、浓度95％乙醇进行梯度脱水，各梯度间隔为1.5h。随后，倒除95％乙醇，加入等体积无水乙醇浸泡处理1.5h,更换无水乙醇再浸泡处理1.5h,以保证脱水彻底。5.根据权利要求1-4所述的芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(2)中，所述根茎组织透明，具体为：脱水完成后，加入等体积的体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液浸泡处理2h，然后更换纯二甲苯浸泡2h，再次更换纯二甲苯浸泡处理2h。6.根据权利要求1-5所述的芍药地下根茎的石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(2)中，所述根茎组织浸蜡和包埋，具体为：将熔点为60℃的固体石蜡在烘箱中融化成蜡液，待材料透明完成后，加入等体积的体积比为1:1的二甲苯和石蜡混合液，60℃烘箱中保温处理4h以上，之后将混合液倒除，加入等体积的纯石蜡液，60℃烘箱中保温浸蜡，每隔4h以上更换一次纯蜡液，重复3-4次后进行常规石蜡包埋，包埋时将根茎组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：于晓南，张建军，陈莉祺，范永明，程堂仁，张启翔，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11