一种基于RAD-seq对胚胎进行无创PGS的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于RAD‑seq对胚胎进行无创PGS的方法。本发明专利技术保护一种制备DNA文库的方法，包括以下步骤：以囊胚培养液为样本构建DNA文库；构建文库的过程中采用两种限制性内切酶进行基因组DNA的打断。本发明专利技术还保护一种对胚胎进行RAD‑seq的方法，包括以下步骤：(1)以囊胚培养液为样本构建DNA文库；构建文库的过程中采用两种限制性内切酶进行基因组DNA的打断；(2)对步骤(1)构建的DNA文库进行测序。本发明专利技术采用“试管婴儿”操作中的囊胚培养液为原料，对胚胎的染色体非整倍性状况进行分析，进而评估胚胎的发育潜能，为在辅助生殖中选择“正确”的胚胎提供了新的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于RAD-seq对胚胎进行无创PGS的方法
本专利技术涉及一种基于RAD-seq对胚胎进行无创PGS的方法。
技术介绍
RAD标记是紧连限制性内切酶酶切位点的一段短的DNA序列标签，广泛分布于整个基因组。随着研究的不断深入，基于RAD-seq的技术，根据使用酶的数量及酶的特点又划分为ddRAD、2b-RAD、ezRAD等，这些方法在文库构建的难易程度、酶切标签的基因组覆盖度等方面存在一定差异。目前，限制性酶切位点相关DNA测序(restriction-site-associatedDNAsequencing，RAD-seq)已成功应用于SNP标记的开发、动植物重要经济性状的QTL定位、超高密度遗传图谱的构建、群体遗传结构、系统演化分析和辅助全基因组denovo测序等研究领域。胚胎植入前非整倍体筛查(PreimplantGeneticScreening,PGS)是辅助生殖中第三代试管婴儿技术的核心技术。通过PGS分析，可以将胚胎中携带有各种非整倍体变异(CVN)的胚胎筛选掉，选择核型正常的胚胎进行移植，大大提高辅助生殖的成功率。目前用于PGS分析的技术都是基于单细胞全基因组扩增(WGA)建库技术上的。目前主流的WGA技术主要有三种，包括MDA、MALBAC、SurePlex(也称PicoPlex,原理与MALBAC类似)技术。这三种方法，各有优缺点，都能够用于PGS分析，且称为目前业界的主流产品。SurePlex技术相较于其他两种技术，操作简单快速，高稳定性和可重复性，已经成为目前PGS扩增的标准。2016年有研究者采用MALBAC技术对囊胚培养液中的基因组DNA片段进行全基因组扩增(WGA),通过二代测序分析胚胎染色体的非整倍体，结果显示，无创染色体筛查(NICS)技术的灵敏度为88.2％，特异性为84％，表明囊胚培养液中DNA与胚胎细胞DNA有着密切联系。Liu等报道在对88枚胚胎及对应的培养液进行WGA，发现活检细胞与其对应培养液在D3的一致率为64.52％，D6时检测结果的一致率达到90％，并通单核苷酸多态性(SNP)以及IVSII654基因突变位点分析证实培养液中的cDNA起源于胚胎细胞，可以利用培养液在染色体水平对胚胎的遗传物质进行检测。综上所述，胚胎培养液中的DNA是存在的，而利用胚胎培养液中DNA进行PGS的最大优势在于取材方便，避免了细胞活检对胚胎发育潜在的影响，能够真正实现单胎移植，降低多胎妊娠的发生率，帮助患者选择遗传物质正常的胚胎。但是在体外培养过程中多进行单胎培养，一个胚胎的培养液中虽然含DNA但量极少且培养液成分复杂，这使得培养液中DNA的提取及分析非常困难，虽然可以经过WGA扩增增加DNA的含量，但也会出现假阴性结果和假阳性的结果，导致结果误判。因此需要有不同于目前基于WGA的检测体系以改善检测结果。综上所述，目前主流评价胚胎发育潜能的技术有如下不足：目前主流的PGS采用的是囊胚阶段的滋养层细胞活检，这种活检虽然尚未证明对胚胎及试管婴儿有害，但在操作技术上要求较高，操作不当会引起胚胎停育等后果；滋养层细胞可能存在嵌合的情况，所取少数3-5个细胞可能不能完全代表胚胎，进而造成误判。因此，急需一种无创检测胚胎发育潜能的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于RAD-seq对胚胎进行无创PGS的方法。本专利技术保护一种制备DNA文库的方法，包括以下步骤：以囊胚培养液为样本构建DNA文库；构建文库的过程中采用两种限制性内切酶进行基因组DNA的打断。所述DNA文库为胚胎的DNA文库。本专利技术还保护一种对胚胎进行RAD-seq的方法，包括以下步骤：(1)以囊胚培养液为样本构建DNA文库；构建文库的过程中采用两种限制性内切酶进行基因组DNA的打断；(2)对步骤(1)构建的DNA文库进行测序。所述囊胚培养液为将卵裂球期胚胎培养至囊胚成熟阶段后收集的培养液。所述囊胚培养液的制备方法如下：将卵裂球期胚胎置于囊胚培养基(例如G2培养基)中培养至囊胚成熟阶段，在显微镜下刺激囊胚使囊胚皱缩5-15min，然后取走囊胚，收集剩余的培养液，即为囊胚培养液。所述囊胚培养基具体可为囊胚培养基微滴。所述微滴具体可为5-50μl微滴，更具体可为10-20μl微滴。每个微滴培养一个胚胎。所述卵裂球期胚胎的制备方法如下：取MⅡ期成熟卵细胞，取精子，采用单精子注射获得受精卵，在卵裂球培养基(例如G1培养基)中培养至卵裂球期。以囊胚培养液为样本构建DNA文库依次包括如下步骤：①取囊胚培养液，采用裂解酶进行细胞裂解以释放DNA，然后进行酶灭活；②加入两种限制性内切酶进行酶切，然后进行酶灭活；③DNA片段补平和加A；④加接头；⑤PCR扩增，得到文库溶液。所述PCR扩增可为两次PCR扩增。第一次PCR扩增，回收DNA片段。第二次PCR扩增,回收200-500bp的DNA片段。所述步骤①中，裂解酶的工作浓度可为1-30mg/ml。所述步骤①中，细胞裂解条件可为37-65℃孵育30min-12h。所述步骤①中，酶灭活条件可为60-80℃孵育10-45min。所述步骤①具体为：取囊胚培养液，加入10×bufferA和裂解酶(使bufferA在体系中的浓度为1×，裂解酶在体系中的浓度为2mg/ml)，混匀后离心于管底，50℃孵育3h，然后75℃孵育30min。所述步骤②中，酶切条件可为37℃-75℃处理1-6小时。所述步骤②中，酶灭活条件可为60-80℃孵育10-45min。所述步骤②具体为：取7.5-10μl前一步骤的产物，加入两种限制性内切酶和10×bufferB(体系中，bufferB的浓度为1×，两种限制性内切酶的的含量均为9U)，先75℃孵育2h再37℃孵育2h，然后80℃孵育20min。所述步骤③中，在37℃条件下进行DNA片段补平和加A。所述步骤③具体为：完成前一步骤后，加入Klenow、10×bufferB和末端修复dNTPmix(体系总体积为20μl，用Nuclease-freeWater补齐；体系中，Klenow的含量为5U，bufferB的浓度为1×，dATP的浓度为40μM、dCTP的浓度为4μM、dGTP的浓度为4μM)，混匀后离心至管底，37℃孵育40分钟，然后75℃孵育15分钟。末端修复dNTPmix提供的有效成分为dATP、dCTP和dGTP。所述步骤④中，借助T4DNA连接酶加接头。所述步骤④中，先16℃预连接30min，然后4℃连接过夜或不低于8小时。所述步骤④具体为：完成前一步骤后，加入T4DNALigase、10×bufferB、ATP和adapter(体系总体积为25μl，用Nuclease-freeWater补齐；体系中，T4DNALigase的含量为30U，bufferB的浓度为1×，ATP的浓度为1mM，adapter的浓度为0.15μM)，混匀，先16℃孵育30分钟然后4℃孵育8小时，然后65℃孵育20min，然后加入1μlUSER酶，37℃孵育30min。第一次PCR扩增采用的酶可为如下酶中的一种或任意组合：KAPAPhusionhigh-fidelity(HF)PCRmasterMixwithHFbuffer、KFXHiFiDNAPolymerase、TransT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备DNA文库的方法，包括以下步骤：以囊胚培养液为样本构建DNA文库；构建文库的过程中采用两种限制性内切酶进行基因组DNA的打断。

【技术特征摘要】
1.一种制备DNA文库的方法，包括以下步骤：以囊胚培养液为样本构建DNA文库；构建文库的过程中采用两种限制性内切酶进行基因组DNA的打断。2.一种对胚胎进行RAD-seq的方法，包括以下步骤：(1)以囊胚培养液为样本构建DNA文库；构建文库的过程中采用两种限制性内切酶进行基因组DNA的打断；(2)对步骤(1)构建的DNA文库进行测序。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述囊胚培养液为将卵裂球期胚胎培养至囊胚成熟阶段后收集的培养液。4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：以囊胚培养液为样本构建DNA文库依次包括如下步骤：①取囊胚培养液，采用裂解酶进行细胞裂解以释放DNA，然后进行酶灭活；②加入两种限制性内切酶进行酶切，然后进行酶灭活；③DNA片段补平和加...

【专利技术属性】
技术研发人员：张癸荣，费嘉，金治平，王云云，蔡旺庭，刘威达，徐雪，
申请(专利权)人：北京中科遗传与生殖医学研究院有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京,11