一种遗传性出凝血的基因文库构建方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种遗传性出凝血的基因文库构建方法和试剂盒，涉及F5、F7、F8、F9、FGA、VWF、CYCS、TUBB1、MPL、ITGA2B、ITGB3、NBEAL2、MYH9、GP1BA、RBM8A、WAS、GATA1、SERPINC1共18个基因的突变。目标区域为以上18基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域。为保证目标区域全部覆盖，PCR扩增过程中所必须的引物组被分离为两个独立引物组，分别进行目标区域扩增。而后将PCR产物进行测序标签连接、文库洗脱及再扩增，扩增后纯化，得到测序用文库。该建库方法步骤简单快速，有效降低了文库构建的成本，且涵盖了妇科肿瘤的相关基因。结合高通量测序仪，可快速准确得到相关基因变异，对遗传性出凝血有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种遗传性出凝血的基因文库构建方法和试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种遗传性出凝血的基因文库构建方法和试剂盒。
技术介绍
遗传性出凝血疾病(inheritedbleeding,thrombotic,andplateletdisorders，BPD)是一组造成出血、血栓或血小板异常的疾病，主要可分为凝血因子紊乱、血栓性疾病和血小板异常这三大类。而每个种类下面还可以进行细分，如出血性疾病下的凝血因子V和因子VII缺乏症，纤维蛋白原缺乏症和血友病等；血栓性疾病下的抗凝血酶缺乏症和蛋白C缺乏症等；血小板异常下的血小板减少症，先天性无巨核细胞血小板减少症，灰色血小板综合征，May-Hegglin及其他MYH9相关异常，巨大血小板综合征和Wiskott-Aldrich综合征等。这些疾病大概影响万分之三的新生儿。遗传性出凝血疾病在临床上的明确诊断主要依据一系列实验室检验方法，而实验指标的选择可能与其血栓或出血的性质相关。比如，对于易栓症来说，应先做遗传表型测定(蛋白分子活性及其抗原水平)，后做基因分析，但对于某些缺乏遗传表型指标的疾病来说，可直接进行基因分析，如凝血酶原G20210A。此外，其检测结果可能受到多种因素的影响。比如，针对易栓症分型的抗凝血酶，蛋白C和S的检测均受到患者自身治疗和急性血栓事件的影响，从而需要在发病或治疗结束后一段时间进行；此外，还要尽量避免在妊娠、口服避孕药或雌激素替代治疗期间采集样本。但是，基因检测就完全不受外界诸多因素的干扰，可以直接给出准确的结果，如针对凝血因子VLeiden突变及凝血酶原G20210A。F5(coagulationfactorV)该基因编码凝血级联的重要辅助因子。该因子在血浆中循环，并通过凝血酶释放激活肽而转化为活性形式。这就产生了一条重链和一条轻链，它们由钙离子连接在一起。活化蛋白是与活化凝血因子X共同参与凝血酶原到凝血酶的辅因子。该基因缺陷可导致常染色体隐性出血性素质或常染色体显性血栓形成。F7(coagulationfactorVII)该基因编码凝血因子VII，这是一种维生素k依赖因子必不可少的止血。该因子以酶原形式在血液中循环，通过IXa因子、Xa因子、XIIa因子或少量蛋白水解凝血酶将其转化为活性形式。当因子VII被激活时，一个含有催化结构域的重链和一个含有2个类似egf结构域的轻链被生成，两个链被一个二硫化键连接在一起。在因子III和钙离子的存在下，活化因子通过将因子IX转化为因子IXa和/或因子X转化为因子Xa进一步激活凝血级联。该基因的缺陷可导致凝血功能障碍。F8(coagulationfactorVIII)该基因编码参与凝血内源性通路的凝血因子VIII；因子VIII是因子IXa的辅因子，IXa在有Ca2+和磷脂的情况下，将因子X转化为活化的Xa。这个基因产生两个交替剪接的转录本。转录变体1编码一个大糖蛋白，亚型a，在血浆中循环，并与非共价复合物中的vonWillebrand因子结合。这种蛋白质经历多次分裂事件。转录变体2编码一个假定的小蛋白，亚型b，它主要由因子VIIIc的磷脂结合域组成。这种结合域对于凝血活性至关重要。该基因缺陷导致血友病A，一种常见的隐性x连锁凝血障碍。F9(coagulationfactorIX)该基因编码维生素k依赖性凝血因子IX，它作为一种不活跃的酶原在血液中循环。这个因子被XIa因子转化为一种活性形式，它切除了激活肽，从而产生一个重链和一个轻链，由一个或多个二硫键连接在一起。激活因子IX在凝血级联中的作用是通过与Ca2+离子、膜磷脂和因子VIII的相互作用将因子X激活到其活性状态。这种基因的改变，包括点突变，插入和删除，导致因子IX缺乏，这是一种隐性的x连锁疾病，也被称为血友病BFGA(fibrinogenalphachain)该基因编码凝血因子纤维蛋白原的亚基，纤维蛋白原是血凝块的组成部分。血管损伤后，在纤维蛋白原转化为纤维蛋白的过程中，凝血酶对编码的前原蛋白进行蛋白水解。该基因的突变导致多种疾病，包括纤维蛋白原血症、低纤维蛋白原血症、非纤维蛋白原血症和肾淀粉样变性。VWF(vonWillebrandfactor)该基因编码参与止血的糖蛋白。编码的前原蛋白在组装成大型多分子配合物后被蛋白水解。这些复合物在血小板与血管损伤部位的粘附和血液中各种蛋白质的运输中起作用。这种基因的突变导致了冯·威尔布兰德病，一种遗传性出血疾病。CYCS(cytochromec,somatic)该基因编码一种小血红素蛋白，作为线粒体电子传递链的中心组成部分。编码蛋白与线粒体的内膜结合，在那里它接受细胞色素b的电子并将其转移到细胞色素氧化酶复合体。这种蛋白也参与了细胞凋亡的启动。该基因突变与常染色体显性非综合征血小板减少有关。TUBB1(tubulinbeta1classVI)该基因编码β微管蛋白家族的成员。管蛋白是两个核心蛋白家族(α和β管蛋白)之一，它们异二聚并组合成微管。该蛋白在血小板和巨核细胞中特异性表达，可能参与血小板生成和血小板释放。该基因的突变与常染色体显性巨血小板减少有关。MPL(MPLproto-oncogene,thrombopoietinreceptor)c-mpl编码了一种与造血受体超家族成员同源的蛋白。c-mpl的反义寡脱氧核苷酸的存在抑制了巨核细胞集落的形成。1994年克隆了c-mpl的配体，血小板生成素。血小板生成素是巨核细胞生成和血小板形成的主要调节因子。由c-mpl基因CD110编码的蛋白是一个635氨基酸跨膜结构域，有两个细胞外细胞因子受体域和两个细胞内细胞因子受体盒基序。TPO-R缺陷小鼠血小板减少严重，强调CD110和血小板生成素在巨核细胞和血小板形成中的重要作用。当血栓生成素CD110结合后，非受体酪氨酸激酶的JAK家族，以及STAT家族、MAPK家族、转导蛋白Shc和受体本身都被磷酸化酪氨酸。ITGA2B(integrinsubunitalpha2b)这个基因编码整合素链家族的一个成员蛋白质。编码前原蛋白经蛋白水解生成轻而重的链，通过二硫键结合形成alpha-IIb/beta-3整合素细胞粘附受体的亚基。这种受体通过介导血小板聚集在血液凝固系统中起着至关重要的作用。这种基因的突变与血小板型出血疾病有关，这种疾病的特征是血小板聚集失败，包括Glanzmann血小板减少症。ITGB3(integrinsubunitbeta3)ITGB3蛋白产物是整合素β链β3。整合素是由一个链和一个链组成的完整的细胞表面蛋白质。一个给定的链可能与多个伙伴结合，导致不同的整合素。在血小板中，整合素β3和αIIb链一起被发现。整合素已知参与细胞粘附以及细胞表面介导的信号传递。NBEAL2(neurobeachinlike2)该基因编码的蛋白包含beigeandChediak-Higashi(BEACH)构域和多个WD40结构域，可能参与巨核细胞-颗粒生物发生。这种基因的突变是导致灰色血小板综合征的原因之一。MYH9(myosinheavychain9)该基因编码常规非肌肉肌球蛋白；这种蛋白不应该与非传统的肌球蛋白9a或9b(肌球蛋白9a或肌球蛋白9b)混淆。编码蛋白是一种肌球蛋白IIA重链，包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)DNA质量标准：受试者样本的基因组DNA，经过核酸提取、质量检测后，要求基因组DNA符合相应的控制标准；(2)目标区域扩增：利用上述(1)DNA及合成的5’端磷酸化修饰的相应引物组，对目标区域进行PCR扩增；(3)测序标签连接：在DNA连接酶作用下利用上述步骤(2)的PCR产物连接高通量测序平台专用测序标签，测序标签含有区分样本的特异性标签序列；(4)文库纯化：步骤(3)的产物中加入纯化磁珠后混匀纯化；(5)产物洗脱及扩增：在上述步骤(4)中加入PCR扩增预混液，进行PCR扩增反应；(6)扩增产物纯化：在上述步骤(5)的PCR产物中加入磁珠纯化即得文库；(7)文库质检：使用Qubit荧光计对步骤(6)中文库进行定量质检。

【技术特征摘要】
1.一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)DNA质量标准：受试者样本的基因组DNA，经过核酸提取、质量检测后，要求基因组DNA符合相应的控制标准；(2)目标区域扩增：利用上述(1)DNA及合成的5’端磷酸化修饰的相应引物组，对目标区域进行PCR扩增；(3)测序标签连接：在DNA连接酶作用下利用上述步骤(2)的PCR产物连接高通量测序平台专用测序标签，测序标签含有区分样本的特异性标签序列；(4)文库纯化：步骤(3)的产物中加入纯化磁珠后混匀纯化；(5)产物洗脱及扩增：在上述步骤(4)中加入PCR扩增预混液，进行PCR扩增反应；(6)扩增产物纯化：在上述步骤(5)的PCR产物中加入磁珠纯化即得文库；(7)文库质检：使用Qubit荧光计对步骤(6)中文库进行定量质检。2.如权利要求1所述的一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，上述步骤(1)中所述的DNA质控标准为，采用Qubit荧光计测量DNA浓度≥1ng/μL；DNA纯度：OD260/280＝1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:2ng。3.如权利要求1所述的一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的目标区域包含以下基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域：F5、F7、F8、F9、FGA、VWF、CYCS、TUBB1、MPL、ITGA2B、ITGB3、NBEAL2、MYH9、GP1BA、RBM8A、WAS、GATA1、SERPINC1。4.如权利要求1所述的一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，步骤(2)中进行目标区域PCR扩增的引物组为两个独立的引物组，分别进行目标区域扩增，每个引物的扩增产物长度均在1...

【专利技术属性】
技术研发人员：扶媛媛，周洋，曹彦东，杨颖，
申请(专利权)人：北京安智因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11