抗病毒药物筛选方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种抗病毒药物筛选方法及其应用，涉及药物筛选技术领域。本发明专利技术提供的抗病毒药物筛选方法，包括以下步骤：将病毒吸附至单层细胞后，覆盖培养基并加入待筛选药物进行孵育；然后将细胞进行固定和染色现出空斑，通过观察空斑来筛选抗病毒药物。本发明专利技术的筛选方法操作简单、成本低、筛选通量大，完全模拟活病毒的感染过程，能够准确高效地筛选出针对病毒复制所有阶段的抗病毒药物，能够缓解现有抗病毒药物筛选方法筛选范围小，工艺繁琐，成本高的技术问题。将本发明专利技术提供的抗病毒药物筛选方法应用于制备治疗病毒感染性疾病的药物，用于治疗因病毒感染而导致的疾病。

【技术实现步骤摘要】
抗病毒药物筛选方法及其应用
本专利技术涉及药物筛选
，尤其是涉及一种抗病毒药物筛选方法及其应用。
技术介绍
现有的抗病毒药物筛选系统是将病毒转录复制相关的基因和荧光素酶报告基因构建于真核表达载体上，然后共转染宿主细胞，再用荧光检测设备来检测药物对荧光强度的影响，从而筛选出有效的抗病毒药物。如抗埃博拉病毒药物筛选系统和抗流感病毒药物的筛选系统；还有针对病毒包膜的特定蛋白，涉及病毒的组织亲嗜性，比如针对流感病毒神经氨酸酶NA的磁珠法筛选系统。然而，现有筛选系统只能筛选出针对病毒感染某个阶段的抗病毒药物，比如装配阶段，而对于其他阶段如吸附，脱壳等，还需要设计其他的筛选系统；病毒通过基因工程加入报告基因后，会导致结构改变，并不能完全模拟活病毒的感染；针对不同病毒需要设计不同的病毒复制质粒或假病毒以及报告基因，且操作过程比较复杂。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种抗病毒药物筛选方法，该筛选方法操作简单，成本低，筛选通量大，完全模拟活病毒的感染过程，能够筛选出针对病毒复制所有阶段的抗病毒药物，能够解决上述问题中的至少一种。本专利技术的第二个目的在于提供抗病毒药物筛选方法在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用，制备出新的抗病毒药物用于治疗因病毒感染而导致的疾病。为了解决上述技术问题，特采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种抗病毒药物筛选方法，包括以下步骤：将病毒吸附至单层细胞后，覆盖培养基并加入待筛选药物进行孵育；然后将细胞进行固定和染色现出空斑，通过观察空斑来筛选抗病毒药物。作为进一步技术方案，所述病毒为具有完全感染能力的活病毒；优选地，所述病毒包括动物病毒；优选地，所述动物病毒包括肠道病毒、疱疹病毒、轮状病毒和流感病毒中的至少一种；优选地，所述病毒的加入量为使每平方厘米单层细胞产生5～25个空斑；优选地，所述病毒的加入量为使每平方厘米单层细胞产生10～20个空斑；优选地，所述病毒吸附的时间为0.8～1.2h，优选为1h。作为进一步技术方案，所述细胞包括动物细胞；优选地，所述动物细胞包括肠上皮细胞、羊膜细胞和成纤维细胞中的至少一种。作为进一步技术方案，所述培养基包括微晶纤维素；优选地，微晶纤维素在培养基中的浓度为0.3％～1.5％，优选为1.2％。作为进一步技术方案，所述待筛选药物的浓度为50～1000μM，优选为50～150μM；优选地，所述待筛选药物的加入量为0.8％～1.2％(v/v)，优选为1％(v/v)。作为进一步技术方案，所述固定所用到的固定液包括中性甲醛固定液、乙醇固定液和多聚甲醛固定液中的至少一种，优选为中性甲醛固定液；优选地，中性甲醛固定液的浓度为4％～10％，优选为8％；优选地，中性甲醇固定液的加入量为80％～120％(v/v)，优选为100％(v/v)；优选地，中性甲醛固定液的固定时间为0.8～1.2h，优选为1h。作为进一步技术方案，所述染色包括中性红染色、结晶紫染色和苏木精-伊红染色，优选为中性红染色；优选地，中性红溶液的浓度为0.1％～1.5％，优选为0.3％。作为进一步技术方案，所述染色后还包括清洗和晾干的步骤。作为进一步技术方案，所述单层细胞的培养皿包括6孔、12孔、24孔、48孔和96孔培养板，优选为96孔培养板；优选地，96孔培养板上每种药物设2～4个复孔；优选地，96孔培养板上不加药物的对照孔至少为3个。第二方面，本专利技术提供了一种抗病毒药物筛选方法在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的抗病毒药物筛选方法，通过将病毒吸附至单层细胞后，覆盖培养基并加入待筛选药物进行孵育，然后将细胞进行固定和染色，通过观察空斑来筛选抗病毒药物。本专利技术的筛选方法操作简单，不需要额外设计和构建报告基因系统，不涉及质粒构建和转染，不涉及单克隆抗体；并且该方法成本低，试剂廉价，低耗材，不需要使用其他的大型高端设备；此外，还具有筛选通量大的优点，能够同时实现对几十种药物的筛选；本专利技术提供的筛选方法完全模拟活病毒的感染过程，能够准确高效地筛选出针对病毒复制所有阶段的抗病毒药物，能够缓解现有抗病毒药物筛选方法筛选范围小，工艺繁琐，成本高的技术问题。将本专利技术提供的抗病毒药物筛选方法应用于制备治疗病毒感染性疾病的药物中，用于治疗因病毒感染而导致的疾病。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1提供的空斑形成流程图；图2为本专利技术实施例1提供的病毒唑抑制EV-A71病毒空斑形成图；图3为本专利技术实施例2提供的结果判读示意图。具体实施方式下面将结合实施方式和实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。第一方面，在一些具体的实施方式中提供了一种抗病毒药物筛选方法，包括以下步骤：将病毒吸附至单层细胞后，覆盖培养基并加入待筛选药物进行孵育；然后将细胞进行固定和染色现出空斑，通过观察空斑来筛选抗病毒药物。现有的抗病毒药物筛选系统是将病毒转录复制相关的基因和荧光素酶报告基因构建于真核表达载体上，然后共转染宿主细胞，再用荧光检测设备来检测药物对荧光强度的影响，从而筛选出有效的抗病毒药物。然而，现有抗病毒药物的筛选系统中存在着筛选范围小，不能完全模拟病毒的感染过程和操作复杂繁琐等问题。鉴于此，特提出本专利技术的抗病毒筛选方法，包括以下步骤：首先，将病毒吸附至单层细胞上。将细胞于培养基中培养至单层细胞后，弃去培养基，加入适宜浓度的病毒溶液，使得病毒吸附在单层细胞上。然后，覆盖培养基。在本专利技术中，通过观察被感染细胞的存活量来判断抗病毒药物的效果，因此，需要向单层细胞中添加培养基等营养物质将被病毒感染的细胞培养一段时间。由于后续还要添加待筛选药物，且待筛选药物要能够与细胞相接触，所以添加的培养基需要保证具有高流动性和低粘度。随后，加入待筛选药物。待筛选药物加入后会通过培养基逐渐扩散到病毒和细胞表面，如果待筛选药物具有抗病毒的效果，则会发挥相应的抗病毒作用。根据抗病毒药物的作用机制主要分为以下几种：穿入和脱壳抑制剂、DNA多聚酶抑制剂、逆转录抑制剂、蛋白质抑制剂、神经氨酸酶抑制剂和广谱抗病毒药物。本专利技术提供的抗病毒药物筛选方法，其待筛选药物加入的阶段为病毒的吸附阶段，但这只是起始的病毒吸附阶段，空斑的扩大还是依赖于病毒不停地从宿主细胞释放以及吸附新宿主细胞，因此，本专利技术的筛选方法是可以筛选出包括吸附，侵入，脱壳，生物合成，装配与释放的所有阶段的抗病毒药物的。再对细胞进行孵育。加入待筛选药物后，将细胞置于适宜的培养条件下进行孵育。需要说明的是，根据细胞的种类不同需要设置不同的培养条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗病毒药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：将病毒吸附至单层细胞后，覆盖培养基并加入待筛选药物进行孵育；然后将细胞进行固定和染色现出空斑，通过观察空斑来筛选抗病毒药物。

【技术特征摘要】
1.一种抗病毒药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：将病毒吸附至单层细胞后，覆盖培养基并加入待筛选药物进行孵育；然后将细胞进行固定和染色现出空斑，通过观察空斑来筛选抗病毒药物。2.根据权利要求1所述的抗病毒药物筛选方法，其特征在于，所述病毒为具有完全感染能力的活病毒；优选地，所述病毒包括动物病毒；优选地，所述动物病毒包括肠道病毒、疱疹病毒、轮状病毒和流感病毒中的至少一种；优选地，所述病毒的加入量为使每平方厘米单层细胞产生5～25个空斑；优选地，所述病毒的加入量为使每平方厘米单层细胞产生10～20个空斑；优选地，所述病毒吸附的时间为0.8～1.2h，优选为1h。3.根据权利要求1所述的抗病毒药物筛选方法，其特征在于，所述细胞包括动物细胞；优选地，所述动物细胞包括肠上皮细胞、羊膜细胞和成纤维细胞中的至少一种。4.根据权利要求1所述的抗病毒药物筛选方法，其特征在于，所述培养基包括微晶纤维素；优选地，微晶纤维素在培养基中的浓度为0.3％～1.5％，优选为1.2％。5.根据权利要求1所述的抗病毒药物筛选方法，其特征在于，所述待筛选药物的浓度为50～1000μM，优选为50～150μM；优选地，所述待筛选药物的加入量为0.8...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹应先，
申请(专利权)人：广州市妇女儿童医疗中心，
类型：发明
国别省市：广东,44