一种基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法技术

本发明专利技术属于体外诊断技术领域，公开了一种基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法；设计并筛选出高效并特异性扩增HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的引物；通过RPA反应扩增HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸，包括DNA或mRNA。本发明专利技术的特异性达100％，灵敏度为10拷贝/反应；且本发明专利技术中的RPA等温扩增体系，反应迅速，不需要复杂的控温体系，在37‑42摄氏度条件下均可实现靶基因的有效扩增，适用于HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的现场快速检测；利用本发明专利技术提供的RPA检测方法进行检测，检测条件温和，检测时间短，使用更加便捷。

【技术实现步骤摘要】
一种基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法
本专利技术属于体外诊断
，尤其涉及一种基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：HPV病毒是人类乳头瘤病毒的缩写，是一种乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒感染引起的一种性传播疾病。主要类型为HPV1、2、6、11、16、18、31、33及35型等，HPV16和18型长期感染可能与女性宫颈癌有关。HPV病毒侵入子宫颈基底膜，被感染的细胞一部分横向扩散，另一部分迁移到鳞状上皮细胞，病毒整合到鳞状上皮细胞中，然后大量繁殖，受感染的鳞状上皮细胞逐步演变成CIN1、CINII、CINIII，直至宫颈癌，但是并非所有被感染的细胞都会转换成癌细胞。目前，宫颈癌的诊断及检测方法主要有组织病理学检测法、TCT(液基薄层细胞学技术)检测法、HPV核酸扩增检测法。组织病理检测法有时很难将CIN与非瘤病变、不同级别的CIN准确鉴别开来，而不同级别的CIN治疗是不同的，且有一定的创伤。TCT的重复性不好，会受环境及医师经验等因素的影响，与活检的一致性不高，敏感性40％-60％。HPV核酸扩增检测法是一种基于PCR的检测方法，需要复杂的温度控制设备，而且无法直接检测HPV的mRNA，约95％的高危HPV-DNA感染者并不会发展成宫颈癌，无法确定病毒感染的真实致癌性。临床急需一种检测速度快且灵敏度高的检测技术，更有利于患者的及时诊治。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有技术中组织病理检测法有时很难将CIN与非瘤病变、不同级别的CIN准确鉴别开来，而不同级别的CIN治疗是不同的，另外，组织病理学检测需要进行活体穿刺，穿刺过程中穿刺针可能造成子宫损失或出血等，对身体有一定的创伤。(2)现有技术中TCT的重复性不好，会受环境及医师经验等因素的影响，与活检的一致性不高，另外提取细胞样品的过程简易和范围有限容易造成假阴性，因此检测的敏感性仅为40％～60％，一些阳性患者会出现漏诊。(3)现有技术中HPV核酸扩增检测法是一种基于PCR的检测方法，但是需要复杂的温度控制设备，而且无法直接检测HPV的mRNA，约95％的高危HPV-DNA感染者并不会发展成宫颈癌，无法确定病毒感染的真实致癌性。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法，该检测不需要进行活体穿刺，具有很高的灵敏度和特异性，而且不仅可以检测DNA，也可以检测mRNA。本专利技术是这样实现的，一种基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法，具体包括以下步骤：步骤一：设计并筛选出高效并特异性扩增HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的引物；步骤二：通过RPA反应扩增HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸。进一步，步骤一中，RPA引物具有以下特点：(1)5’端3到5个核苷酸避免聚鸟嘌呤，最好是胞嘧啶，能促进重组；(2)3’端3个核苷酸是G或C有助于聚合酶的稳定性；(3)不要出现聚嘌呤和嘧啶；(4)GC含量在30-70％之间，避免形成二级结构，发卡结构等；(5)扩增区域避开重复元件。进一步，步骤一中，根据不同的靶基因(包括HPV16的E6或E7，以及HPV18的E6或E7等)，引物序列不同，但大小都在20-40个核苷酸之间。进一步，步骤一中，引物序列优选为30-35个核苷酸。进一步，步骤一中，引物与靶基因的序列互补匹配，同时也包括进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或替换后得到的与原引物具有相同扩增性能的单链DNA分子。进一步，步骤一中，优选为与靶基因序列完全互补匹配。进一步，步骤一中，扩增序列都在靶基因的范围内，大小约但不限于80-250个核苷酸。进一步，步骤一中，扩增序列优选为100-200个核苷酸。进一步，步骤二中，RPA反应扩增HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸具体步骤为：(1)以待测样品作为模板，将筛选出的不同的RPA引物加入至RPA反应体系中，进行RPA扩增反应；(2)通过琼脂糖凝胶电泳观察，根据是否含有大小对应的核酸片段，判断待测样品是否包含HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸成分。进一步，步骤二中，RPA反应体系包括2.4μl前引物10μM，2.4μl后引物10μM，29.5μlRPA缓冲液，2μl检测样品，11.2μl双蒸水，2.5μl醋酸镁280mM；醋酸镁一旦加入，反应即开始计时。进一步，步骤二中，RPA反应可在36-42摄氏度进行，反应时间为15-40分钟。进一步，步骤二中，RPA反应优选为37摄氏度，反应30分钟。进一步，步骤二中，通过琼脂糖凝胶电泳观察，最终结果判断标准为，RPA反应产物含有大小对应的核酸片段，则判断待测样品包含HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸成分；RPA反应产物不含有大小对应的核酸片段，则判断待测样品不包含或候补不包含HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸成分。进一步，该方法既可以检测靶基因的DNA，也可以通过加入逆转录试剂检测靶基因的mRNA；优选为DNA检测。本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法的检测的靶基因DNA。本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法的检测的靶基因的mRNA。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：1、利用本专利技术公开的RPA检测方法进行检测，以筛选的引物和对应的含有HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的质粒DNA为模板时，可以得到明显的电泳条带，然而当引物与序列不对应时以及人类基因组作为阴性对照模板时，没有得到电泳条带，证明了检测方法的高度特异性，特异性达100％。2、利用本专利技术公开的RPA检测方法进行检测，以筛选的引物和对应的含有HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的质粒DNA为模板时，将模板用双蒸水进行稀释后，可以检测到10个拷贝的靶基因，证明了该方法的高度灵敏性。3、利用本专利技术公开的RPA检测方法进行检测，检测条件温和，检测时间短，使用更加便捷。附图说明图1是本专利技术实施例提供的基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的筛选出的针对HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的RPA引物的RPA反应扩增效果示意图。图3是本专利技术实施例提供的筛选出的针对HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的RPA引物的特异性验证示意图。图4是本专利技术实施例提供的筛选出的针对HPV16的E6核酸的RPA引物的灵敏度验证示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。为了解决现有的技术问题，本专利技术提供一种基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸HPV16和HPV18病毒E6和E7核酸的序列，设计RPA引物，通过RPA反应可有效地扩增靶基因(包括DNA或mRNA)，特异性达100％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法，其特征在于，所述的基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法包括以下步骤：步骤一：筛选出高效并特异性扩增HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的引物；步骤二：通过RPA反应扩增HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸。

【技术特征摘要】
1.一种基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法，其特征在于，所述的基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法包括以下步骤：步骤一：筛选出高效并特异性扩增HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的引物；步骤二：通过RPA反应扩增HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸。2.如权利要求1所述的基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法，其特征在于，所述步骤一中，RPA引物具有：(1)5’端3到5个核苷酸避促进重组；(2)3’端3个核苷酸是G或C；(3)不要出现聚嘌呤和嘧啶；(4)GC含量30-70％；(5)扩增区域避开重复元件。3.如权利要求1所述的基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法，其特征在于，所述步骤一中，根据不同的靶基因HPV16的E6或E7，以及HPV18的E6或E7，引物序列不同，大小20-40个核苷酸。4.如权利要求1所述的基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法，其特征在于，所述步骤一中，引物与靶基因的序列互补匹配，同时也包括进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或替换后得到的与原引物具有相同扩增性能的单链DNA分子。5.如权利要求1所述的基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法，其特征在于，所述步骤一中，扩增序列为100-200个核苷酸。6.如权利要求1所述的基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法，其特征在于，所述步...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑筱玮，
申请(专利权)人：郑筱玮，
类型：发明
国别省市：天津,12