用于检测病毒的DNA四面体探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种用于检测病毒的DNA四面体探针及试剂盒。所述探针整体为DNA四面体结构，所述四面体的一个顶点上延伸出DNA识别序列和茎序列，所述茎序列能够和DNA识别序列结合形成茎环结构，所述DNA四面体探针上修饰有供体荧光分子和受体荧光分子，其中所述供体荧光分子位于所述DNA识别序列上，在未添加检测对象时所述供体荧光分子和受体荧光分子之间的距离不大于7nm。利用上述探针可以快速高效的检测出病毒。

【技术实现步骤摘要】
用于检测病毒的DNA四面体探针及试剂盒
本专利技术涉及一种用于检测病毒的DNA四面体探针及试剂盒。
技术介绍
近年来，随着DNA化学合成技术的发展，DNA成为一种简单易得的生物材料，DNA荧光探针也已成为了分析传感和光学成像的有力工具。DNA四面体具有良好的生物兼容性和容易编码的性质。现有技术中已经存在利用DNA四面体作为骨架，结合荧光共振能量转移(FRET)，构建了可以对活细胞内mRNA进行成像的DNA四面体“纳米镊子”(DNAtetrahedronnanotweezer，DTNT)。乙型肝炎病毒(HBV)，简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科，可导致肝硬化和肝癌的发生，给全球带来严重的疾病负担。目前关于HBV如何侵染正常宿主细胞并在宿主细胞内复制的过程已经取得共识。当HBV侵染正常宿主细胞时，其首先脱去外膜，HBVDNA双链形成松弛的具有“缺口”环状结构(rcDNA)，通过酶的作用，被补齐后转化为空间结构为超螺旋结构的共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)。cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA(pgRNA)复制的原始模板，pgRNA则作为逆转录的模板。尽管现有的抗病毒药物可以控制HBV病毒的复制，但却不能完全清除它。由于cccDNA“匿藏”在细胞核中，一旦停止治疗，患者肝脏中的HBV会重新活化。pgRNA由感染肝细胞核内的cccDNA转录产生。随着核酸提取纯化技术的发展以及实时荧光定量聚合酶链反应(RealTimePolymeraseChainReaction，qPCR)和逆转录聚合酶链反应(ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction，RT-PCR)技术的广泛应用，已经实现了对HBVpgRNA的定量分析，并有相关的检测试剂盒。RNA容易降解，早期体外用于HBVpgRNA检测的方法操作起来较为复杂，耗时长，灵敏度不够高。在活细胞水平实现细胞内HBVpgRNA的检测和成像，将能实现对HBV病毒颗粒入侵宿主细胞的动态过程，以及进入细胞后的转运、病毒核酸和蛋白的去向及定位进行实时动态监测，有助于明确病毒和细胞膜分子粘附、结合、入胞的动态机制。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种用于检测病毒的DNA四面体探针及试剂盒，用于解决现有技术中对病毒检测特异性低，灵敏度低的问题，尤其是HBV。如图1所示，基于DNA四面体纳米结构和FRET效应构建了一种用于检测病毒的DNA四面体纳米荧光探针。以HBV为例，该探针有望实现对活细胞中的HBVpgRNA中的多个位点进行同时检测和成像。这种DNA四面体纳米探针结合DNA四面体纳米结构的优势，生物相容性好，易于编码，能够被细胞摄取并且在细胞内复杂生物体系中能够稳定存在。我们将形成DNA四面体的A链一端修饰CY3，链内修饰CY5形成分子信标探针。CY3和CY5之间可以发生有效的FRET现象，当用CY3的激光器进行激发时，CY3的能量可以部分转移给CY5，使得CY5发出荧光。当加入靶标分子后，目标分子可以将探针的茎环结构打开，形成刚性的双链结构，导致CY3和CY5的距离变远，FRET现象减弱甚至消失。通过FRET效率变化导致的荧光分子信号的变化，实现pgRNA的方便快捷的检测；通过将多种pgRNA识别的FRET-TDN-Probe与转录了乙肝病毒基因组的肝癌细胞进行孵育，实现对细胞内多位点pgRNA的细胞内检测和成像。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种用于检测病毒的DNA四面体探针，所述DNA探针整体为四面体结构，所述四面体的一个顶点上延伸出茎序列，所述茎序列5’端延伸出DNA识别序列，所述茎序列能够和DNA识别序列结合形成茎环结构，所述DNA四面体探针上修饰有供体荧光分子和受体荧光分子，其中所述供体荧光分子位于所述DNA识别序列上，在未添加检测对象时所述供体荧光分子和受体荧光分子之间的距离不大于7nm。所述供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光。优选地，所述供体荧光分子和受体荧光分子分别选自CY3和CY5。CY3(cyanine-3)和CY5(cyanine-5)为现有技术中常用的荧光分子对。进一步地，所述DNA四面体由A、B、C和D四条DNA单链组装而成，所述茎序列自A链的5’端延伸。更进一步地，所述供体荧光分子位于所述DNA识别序列的5’端。进一步地，所述受体荧光分子位于B链1/2位点到1/4位点之间，优选为1/3位点处。所述1/2位点，1/3位点，1/4位点是指位点距离A链的5’端的长度为B链长度的1/2，1/3，1/4。在优选的方案中，所述受体荧光分子位于A链的5’端位置处。所述A、B、C和D条DNA单链为现有技术。其中A链核苷酸序列如SEQIDNO.33:ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA.B链如SEQIDNO.34:TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC。C链如SEQIDNO.35:CAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC。D链如SEQIDNO.36:TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT。例如，当需要检测HBV时，所述DNA识别序列选自SEQIDNO.3、SEQIDNO.8、SEQIDNO.13、SEQIDNO.17或SEQIDNO.19中的任意一种。延伸后的所述DNA四面体探针A链分别如SEQIDNO.23～27所示。进一步地，所述DNA识别序列的含有不低于20个碱基，低于此长度则可能导致探针不能与待检测对象有效的结合。进一步地，所述茎序列的含有6～8碱基。这样长度的碱基序列使得茎环结构很容易被打开。例如，当需要检测HBV时，所述受体荧光分子位于A链的5’端位置处，所述供体荧光分子位于DNA识别序列的5’端，所述DNA识别序列自茎序列的5’端延伸，延伸后的A链核苷酸序列选自SEQIDNO.23-27中的任意一种。本专利技术的另外一个方面提供了一种药物组合物，所述组合包含上述用于检测病毒的DNA四面体探针和辅料。本专利技术的另外一个方面提供了一种病毒检测试剂盒，所述试剂盒包含上述用于检测病毒的DNA四面体探针或药物组合物。本专利技术的另外一个方面提供上述DNA四面体探针在制备上述病毒检测试剂盒中的用途。本专利技术的另外一个方面提供上述药物组合物在制备上述病毒检测试剂盒中的用途。本专利技术的另外一个方面提供上述DNA四面体探针在制备检测病毒的药物中的用途。本专利技术的另外一个方面提供上述药物组合物在制备检测病毒的药物中的用途。如上所述，本专利技术的用于检测病毒的DNA四面体探针及试剂盒，具有以下有益效果：能够特异性识别病毒，具有较高的灵敏性，以HBV为例，有的检测限可达1nM，和特异性，同时检测时间迅速，30min之内即可实现。附图说明图1显示为本专利技术DNA四面体探针发挥作用原理示意图。图2a显示为本专利技术实施例二中利用软件对FRET-TDN-Probe本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测病毒的DNA四面体探针，其特征在于：所述DNA四面体探针整体为四面体结构，所述四面体的一个顶点上延伸出茎序列，所述茎序列5’端延伸出DNA识别序列，所述茎序列能够和DNA识别序列结合形成茎环结构，所述DNA四面体探针上修饰有供体荧光分子和受体荧光分子，其中所述供体荧光分子位于所述DNA识别序列上，在未添加检测对象时所述供体荧光分子和受体荧光分子之间的距离不大于7nm。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测病毒的DNA四面体探针，其特征在于：所述DNA四面体探针整体为四面体结构，所述四面体的一个顶点上延伸出茎序列，所述茎序列5’端延伸出DNA识别序列，所述茎序列能够和DNA识别序列结合形成茎环结构，所述DNA四面体探针上修饰有供体荧光分子和受体荧光分子，其中所述供体荧光分子位于所述DNA识别序列上，在未添加检测对象时所述供体荧光分子和受体荧光分子之间的距离不大于7nm。2.根据权利要求1所述的用于检测病毒的DNA四面体探针，其特征在于：所述供体荧光分子和受体荧光分子分别选自CY3和CY5。3.根据权利要求1所述的用于检测病毒的DNA四面体探针，其特征在于：所述DNA四面体由A、B、C和D四条DNA单链组装而成，所述茎序列自A链的5’端延伸，其中A链核苷酸序列如SEQIDNO.33所示，B链如SEQIDNO.34所示，C链如SEQIDNO.35所示，D链如SEQIDNO.36所示。4.根据权利要求1所述的用于检测病毒的DNA四面体探针，其特征在于：所述受体荧光分子位于B链1/2位点到1/4位点之间或者位于A链的5’端，所述1/2位点到1/4位点之间是指位点距离A链的5’端的长度为B链长度的1/2到1/4之间。5.根据权利要求1所述的用于检测病毒的DNA四...

【专利技术属性】
技术研发人员：宓现强，苏静，何桂芳，
申请(专利权)人：中国科学院上海高等研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31