一种H5亚型禽流感病毒的快速检测方法技术

本发明专利技术提供一种H5亚型禽流感病毒的快速检测方法，通过比对了近年来分离到的H5亚型禽流感病毒HA基因核苷酸序列，在其保守区设计了引物和探针，建立了针对H5亚型禽流感病毒实时荧光定量RT‑PCR核酸快速检测方法。本发明专利技术所提供的H5亚型禽流感病毒实时荧光RT‑PCR方法具有灵敏度高、检测时间短，不需要电泳等开放环节，只需一台荧光PCR仪即可在密闭反应管中完成，且在检测过程中可实时查看反应曲线，对结果作出快速判断。而作为禽流感诊断金标准的病毒分离方法，则需要更多的设备、更长的时间、更高的硬件要求。

【技术实现步骤摘要】
一种H5亚型禽流感病毒的快速检测方法
本专利技术属于病毒检测
，具体涉及一种H5亚型禽流感病毒的快速检测方法。
技术介绍
1996年，我国首次从广东的鹅体内分离到H5N1亚型高致病性禽流感病毒。从2003年末开始，H5N1亚型禽流感在东南亚多个国家的家禽中暴发，包括越南、泰国、韩国、日本、柬埔寨和印度尼西亚。2004年至2015年，我国的多个省份暴发了疫情，超过2千万只禽类被扑杀，给养禽业造成了巨大的经济损失。2005年底开始，我国针对H5亚型禽流感病毒实行大规模强制免疫政策，疫情开始得到了有效控制。实践证明，在禽流感防控方面，疫苗免疫发挥了巨大的作用。但是，不可否认，它也带来了一系列的问题，如免疫加快了病毒变异，使得疫苗必须加快更新换代。随着病毒的进化，H5亚型禽流感病毒一直在发生较快的变异；从最初的N28、Re-1到Re-4、Re-5，再到Re-6、Re-8，到最新的Re-11、Re-12。病毒变异是由于其血凝素基因(HA)中核苷酸的变异引起的。目前，全球H5亚型禽流感病毒共存在10个分支。我国存在或流行的分支包括第0分支、第2.3.4.4分支、第2.3.2.1分支和第7分支共4个分支。我国现在流行的毒株与1996年最初分离的病毒A/goose/Guangdong/1/1996(H5N1)的HA核苷酸同源性仅为90.6％(Re-11)和91.2％(Re-12)。以Re-11和Re-12疫苗株为代表的第2.3.4.4分支和第2.3.2.1分支HA核苷酸同源性仅为88.5％。HA核苷酸的快速变异增加了以核苷酸为靶基因的检测方法的难度，导致以HA基因为靶基因的检测方法的特异性、敏感性下降，造成假阴性的结果。而病毒分离作为禽流感诊断的金标准，耗时较长、需要的硬件较高，不适合临床的快速诊断和应用。
技术实现思路
本专利技术提供一种H5亚型禽流感病毒的快速检测方法，通过比对了近年来分离到的H5亚型禽流感病毒HA基因核苷酸序列，在其保守区设计了引物和探针，建立了针对H5亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR核酸快速检测方法。本专利技术首先提供一种用于H5亚型禽流感病毒检测的引物组和探针，其序列信息如下：其中上游引物的序列为ATGGAAAARAACGTYACTGT(SEQIDNO.1)，下游引物序列为AGCCATCCWGCYACACTRCAAT(SEQIDNO.2)；探针序列为AAGACATACTGGARAAGACACAYAAYGGGA(SEQIDNO.3)，其中探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；本专利技术的引物组和探针用于制备使用实时荧光定量RT-PCR方法检测H5亚型禽流感病毒的试剂盒；本专利技术再一个方面提供一种检测H5亚型禽流感病毒的方法，包括如下的步骤：1)配置反应体系：在聚合酶链式反应管中依次加入含dNTPs、Mg2+的2×qRT-PCR反应缓冲液25μl、水7.0μl、浓度为10μmol/L上游引物2.0μl、浓度为10μmol/L的下游引物2.0μl、浓度为10μmol/L的探针1.5μl、酶混合物2.5μl、需要检测的病毒核酸样品10.0μl；2)反应步骤：将步骤1)配置好的反应体系密闭后，置于荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光；3)结果检测：如果出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断为阳性，否则判断为阴性。本专利技术所提供的H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR方法具有灵敏度高、检测时间短，不需要电泳等开放环节(易造成环境污染)，只需一台荧光PCR仪即可在密闭反应管中完成，且在检测过程中可实时查看反应曲线，对结果作出快速判断。而作为禽流感诊断金标准的病毒分离方法，则需要更多的设备、更长的时间、更高的硬件要求(高致病性禽流感病毒需要在生物安全三级实验室完成)。附图说明图1：HA序列比对图，图2本专利技术建立的实时荧光定量RT-PCR方法敏感性试验图。具体实施方式下面通过实施例来对本专利技术进行详细的描述。实施例1：保守序列区域的确定及引物探针的筛选申请人通过分子生物学方法研究了H5亚型流感病毒的不同NA亚型、不同分支的HA核苷酸序列(表1)，与申请人所在实验室分离保存的H5毒株HA序列进行比对，确定其保守区域(图1)。序列比对发现，H亚型流感病毒的HA序列在nt106–nt174区域，该区域的序列如下：ATGGAAAARAACGTYACTGTWACRCATGCYMAAGACATACTGGARAAGACACAYAAYGGGARGCTYTG；nt210–nt242区域，序列为ATTGYAGTGTRGCWGGATGGCTHCTYGGRAAYCC的保守度较高；其中，R＝A或G，Y＝C或T，M＝或C，W＝A或T。表1：本专利技术中引物和探针设计使用到的病毒株信息表按照荧光定量RT-PCR引物探针设计原则，在不同保守区域设计多对引物和探针，进行筛选，根据检出的灵敏度最终确定了用于H5亚型禽流感病毒检测的最优引物组和探针，其序列信息如下：其中上游引物的序列为ATGGAAAARAACGTYACTGT(SEQIDNO.1)，下游引物序列为AGCCATCCWGCYACACTRCAAT(SEQIDNO.2)；探针序列为AAGACATACTGGARAAGACACAYAAYGGGA(SEQIDNO.3)，其中探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；实施例2：建立检测方法确立了检测反应体系和反应条件，在聚合酶链式反应管中依次加入2×RT-PCR反应缓冲液25μl(含dNTPs、Mg2+)、水7.0μl、第一步所合成的上游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的下游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的探针1.5μl(浓度为10μmol/L)、酶混合物(反转录酶、RNA酶抑制剂、具有具有5'→3'外切活性的Taq酶)2.5μl、需要检测的病毒核酸10.0μl(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)；然后将反应体系密闭，置于荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。如果出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断为阳性，否则判断为阴性。用实时荧光定量RT-PCR技术，对H5亚型禽流感病毒进行核酸快速检测，包括如下步骤：第一步(合成引物)：按照本专利技术指定的核酸序列(即序列表中SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3)，人工合成扩增反应所需要的上下游引物和探针；第二步(配置反应体系)：在聚合酶链式反应管中依次加入2×qRT-PCR反应缓冲液25μl(含dNTPs、Mg2+)、水7.0μl、第一步所合成的上游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的下游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的探针1.5μl(浓度为10μmol/L)、酶混合物(反转录酶、RNA酶抑制剂、具有具有5'→3'外切活性的Taq酶)2.5μl、需要检测的病毒核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于H5亚型禽流感病毒检测的引物组和探针，其特征在于，所述的引物组合探针的序列信息如下：其中上游引物的序列为SEQ ID NO.1，下游引物的序列为SEQ ID NO.2；探针的序列为SEQ ID NO.3。

【技术特征摘要】
1.一种用于H5亚型禽流感病毒检测的引物组和探针，其特征在于，所述的引物组合探针的序列信息如下：其中上游引物的序列为SEQIDNO.1，下游引物的序列为SEQIDNO.2；探针的序列为SEQIDNO.3。2.如权利要求1所述的引物组和探针，其特征在于，所述探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1。3.权利要求1或2所述的引物组和探针在制备使用实时荧光定量RT-PCR方法检测H5亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用。4.一种检测H5亚型禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有荧光定量RT-PCR扩增反应的试剂，和权利要求1或2所述的引物组和探针。5.一种非疾病诊断治疗目的的检测H5亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)配置反应体系：在聚合酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋文明，刘华雷，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东,37