一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合及其应用制造技术

本发明专利技术涉及病毒分子检测领域，具体而言，涉及一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合及其应用。一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合，所述核酸组合包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种，各引物对及其对应的探针如SEQ ID NO：1‑9所示。该核酸组合针对4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒特异基因设计，结合实时荧光定量PCR技术和三重荧光探针，同时对4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒进行检测，具有灵敏度高，特异性好的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合及其应用
本专利技术涉及病毒分子检测领域，具体而言，涉及一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合及其应用。
技术介绍
人类4型疱疹病毒(Epstein-BarrVirμs，EBV)属于疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科，是重要的肿瘤相关病毒，与多种人类淋巴和上皮细胞性肿瘤的发生有关，如Bμrkitt′s淋巴瘤(Bμrkitt′slymphoma，BL)、霍奇金淋巴瘤、免疫缺陷病人的淋巴细胞瘤、鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)和胃癌等，EBV感染十分普遍，特别是儿童时期。呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirμses，简称RSV)是属于副粘液病毒科的一种RNA病毒；是儿童呼吸道病毒感染中最常见的病毒之一。人腺病毒(Hμmanadenovirμs，HAdV)为腺病毒科的哺乳动物腺病毒属一种DNA病毒。人腺病毒在呼吸道病毒中的感染率仅次于呼吸道合胞病毒。急性呼吸道感染是儿童最主要的威胁之一，其中超过90％是由呼吸道病毒感染引起。人类4型疱疹病毒、呼吸道合胞病毒和人腺病毒均可引起世界范围内婴幼儿呼吸道感染，所致疾病的临床症状复杂多样可出现发热、咳嗽、淋巴结肿大等上呼吸道感染症状，多以肺炎、支气管炎、咽炎等临床表现为主，不易区分。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服呼吸道常见病毒与EB病毒感染临床表现不易区分的缺陷，提供一种快速检测4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒的核酸检测试剂盒，该试剂盒具有高通量、操作简便、重复性强、检测结果快速客观等优点。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合，所述核酸组合包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种；第一引物对如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQIDNO：3所示；第二引物对如SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQIDNO：6所示；第三引物对如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示，第三探针的核酸序列如SEQIDNO：9所示。进一步地，所述探针均为自身淬灭探针。进一步地，所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团。进一步地，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、、Qμasar705、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed、LCRED640中的任一种。进一步地，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1、Tamra中的任一种。进一步地，所述核酸组合至少包括两个引物对及其对应的探针，不同探针的5′端标记荧光报告基团不同。如在一些实施例中，核酸组合包括两个引物对及其对应的探针；如在一些实施例中，核酸组合包括三个引物对及其对应的探针。其中，两个引物对及其对应的探针是本专利技术提供的三种中的任意两种的组合。本专利技术还提供了呼吸道病毒的检测试剂盒，包括上述的核酸组合。本专利技术对上述引物和探针的摩尔配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的摩尔配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异。本专利技术通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果。优选地，第一引物对及其对应的探针中，SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3的摩尔比为6:6:4。优选地，第二引物对及其对应的探针中，SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6的摩尔比为6:6:4。优选地，第三引物对及其对应的探针中，SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9的摩尔比为6:6:4。进一步地，所述检测试剂盒还包括样品处理液、空白对照、阳性对照、反应扩增液、Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、定量标准品、去RNA酶水中的任一种或多种。进一步地，Taq酶为热启动Taq酶，逆转录酶为M-MLV逆转录酶。优选地，所述反应扩增液为包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾、氯化镁以及核苷酸的混合液。优选地，所述阳性对照为灭活的4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒培养液；所述空白对照为去RNA酶水。优选地，所述定量标准品为合成的含有4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒特异基因的质粒，利用国际标准品对定量标准品进行定量。本专利技术采用三重荧光定量PCR技术，分别设计针对4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒的特异性引物和探针，实现了在同一反应体系中同时检测4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒的目的。引物和探针的设计采用primer6.0专用软件设计，将设计的引物和探针在NCBI的GeneBank进行比对，检测引物和探针的特异性。引物和探针在专业合成公司合成，采用紫外分光光度计测定光密度值(A260nm/A280nm在1.8-2.0之间为合格)。本专利技术对4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒的检测具有良好的应用前景。本专利技术对各病毒进行检测时，步骤如下：待检测物采用上述的核酸序列组合进行实时荧光定量PCR，得到待测样本中各病毒的Ct值，进而判断是否为阳性。扩增程序如下：第一步：50℃保持20-30min；第二步：94±1℃保持2-5min；第三步：94±1℃保持10-15s，55℃保持40±2s，45±2个循环，其中55℃设置采集荧光信号。采集的荧光信号结果采用以下方法判定：结果判定：4型疱疹病毒(又称EB病毒)：荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.86判断为EB病毒阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.86，且内标的CT≤35.86，判断为EB病毒阴性。腺病毒：荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤34.36，判断为腺病毒阳性；无典型“S”型扩增或CT>34.36，且内标的CT≤34.36，判断为腺病毒阴性。合胞病毒：荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.12，判断为合胞病毒阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.12，且内标的CT≤35.12，判断为合胞病毒阴性。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术提供的试剂盒操作简便且能有效防止污染，PCR荧光检测时间(从标本处理开始)仅为2-3小时，而且在同一反应体系中实现同时检测4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒。PCR荧光检测是全封闭操作，加入样本抽提产物之后可以不再打开管盖，减少了污染产生的机会。(2)本专利技术能够同时检测出4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒，解决了现有产品只能在一管中检测一种病毒的问题。(3)本专利技术还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观等优点，在临床诊断、疾病预防监测领域具有极大的应用前景。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1是本专利技术中三重荧光定量PCR技术原理图；图2是本专利技术实施例1中试剂盒检测样本的曲线图；图3是本专利技术实施例2中检测4型疱疹病毒的灵敏度试验结果图；图4是本专利技术实施例2检测腺病毒的灵敏度试验结果图；图5是本专利技术实施例2检测呼吸道合胞病毒的灵敏度试验结果图；图6是是本专利技术实施例3检测4型疱疹病毒的特异性试验结果图；图7是是本专利技术实施例3检测腺病毒的特异性试验结果图；图8是是本专利技术实施例3检测呼吸道合胞病毒的特异性试验结果图。具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种；第一引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；第二引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQ ID NO：6所示；第三引物对如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，第三探针的核酸序列如SEQ ID NO：9所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种；第一引物对如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQIDNO：3所示；第二引物对如SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQIDNO：6所示；第三引物对如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示，第三探针的核酸序列如SEQIDNO：9所示。2.根据权利要求1所述的用于检测呼吸道病毒的核酸组合，其特征在于，所述探针均为自身淬灭探针；进一步地，所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团。3.根据权利要求2所述的用于检测呼吸道病毒的核酸组合，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、、Qμasar705、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed、LCRED640中的任一种；进一步地，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1、Tamra中的任一种。4.根据权利要求1-3任一项所述的用于检测呼吸道病毒的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合至少包括两个...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓铃，何晓奕，解庆华，唐梦灵，张雨，
申请(专利权)人：重庆博利达医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50