基于对虾东方病毒基因组序列的检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种基于对虾东方病毒基因组序列的检测方法及其应用。所述对虾东方病毒（Orientavirus penaei），属于布尼亚病毒，保藏编号为CCTCC No.V201864。形态呈球形，直径80‑120 nm。能够感染中国对虾，主要症状表现为活力降低，肝胰腺变浅。本发明专利技术还提供了上述对虾东方病毒的检测试剂盒。为甲壳类水产布尼亚病毒的检测与防控提供新的可能。

【技术实现步骤摘要】
基于对虾东方病毒基因组序列的检测方法及其应用
本专利技术属于水产养殖领域，具体涉及对虾东方病毒基因组序列的检测方法及其应用。
技术介绍
国际病毒分类委员会第十次报告中新命名的布尼亚病毒目分为9科13属，科分别为费拉病毒科(Feraviridae)、无花果花叶病毒科(Fimoviridae)、汉坦病毒科(Hantaviridae)、米卡多病毒科(Jonviridae)、内罗病毒科(Nairoviridae)、泛布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)、幻影病毒科(Phasmaviridae)、白纤病毒科(Phenuiviridae)和番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)。费拉病毒科仅有1个病毒属：正费拉病毒属(Orthoferavirus)，主要感染蚊子，不能感染脊椎动物细胞，属于昆虫宿主限制性病毒；无花果花叶病毒科包含伊马拉病毒属(Emaravirus)，可感染植物，并可通过植物嫁接或螨类等节肢动物传播；汉坦病毒科包含正汉坦病毒属(Orthohantavirus)，可经啮齿动物和食虫类动物进行传播，偶尔也感染人类；米卡多病毒科(Jonviridae)包含正米卡多病毒属(Orthojonvirus)，能在多种蚊子细胞中复制扩增，但不能感染脊椎动物细胞，属于昆虫宿主限制性病毒；内罗病毒科包含正内罗病毒属(Orthonairovirus)，该科病毒大部分以蜱、蚊为媒介传播，部分病毒也可在虱子、蠓等节肢动物中传播，或者通过蜱虫在不同宿主之间进行传播。内罗病毒科在非洲、亚洲、澳洲、欧洲和美洲均有分布，传染性强、致死率高，能够引起多种严重的人类及动物传染性疾病；泛布尼亚病毒科由赫伯病毒属和正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)组成，其中，正布尼亚病毒可感染人和反刍动物，可引起病人的如发热、脑炎和出血热等严重疾病；幻影病毒科包含正幻影病毒属(Orthophasmavirus)，仅感染蟑螂、尺蛾和蚊，属于昆虫宿主限制性病毒；白纤病毒科由格克病毒属、帕西病毒属(Phasivirus)、白蛉病毒属(Phlebovirus)和纤细病毒属(Tenuivirus)组成，格克病毒属仅能感染蚊，尚未有感染其他脊椎动物和节肢动物的报道；帕西病毒属可感染苍蝇和蚊等节肢动物，尚未有感染脊椎动物的报道；白蛉病毒属病毒都是虫媒病毒，可通过白蛉、蜱、蠓和蚊子等节肢动物传播，感染多种哺乳动物和人类，严重影响人类健康；纤细病毒属是一类植物病毒，可在植物细胞内扩增，通过飞虱、叶蝉传播；番茄斑萎病毒科包含正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)，可通过植物枝叶进行传播，可通过昆虫媒介蓟马在寄主植株间传播。1996年，澳大利亚学者在北昆士兰州毛利镇(Mourilyan)的发病斑节对虾中首次鉴定了一株布尼亚病毒-毛利病毒(Mourilyanvirus,MoV)，该病毒随后在东南亚及澳大利亚的日本对虾和斑节对虾中均有报道，已有研究证明毛利病毒对日本对虾有致病性。2018年澳大利亚学者Sakuna报道了从红螯螯虾中发现了一株新的布尼亚病毒，系统发育进化树显示该病毒与泛布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)的正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)的亲缘关系最近，并推测该病毒与红螯螯虾长途运输后的高死亡率相关。目前，发现能够感染甲壳纲动物的布尼亚病毒有限。
技术实现思路
针对目前缺乏检测和防控甲壳类布尼亚病毒产品的问题，本专利技术提供一株对虾东方病毒(Orientaviruspenaei)，属于布尼亚病毒目的新种，能够感染甲壳类动物。本专利技术的另一目的在于提供一种检测上述新型布尼亚病毒株的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一株对虾东方病毒(Orientaviruspenaei)，属于布尼亚病毒目，于2018年12月06日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.V201864。所述对虾东方病毒呈球形，由囊膜、衣壳和三节段的负链RNA病毒组成，直径为70-120nm。能够感染中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)等，主要症状表现为活力降低，肝胰腺变浅。对虾东方病毒的基因组序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示；其中，L节段的序列如SEQIDNO:1所示，M节段的序列如SEQIDNO:2所示，S节段的序列如SEQIDNO:3所示。一种检测类对虾东方病毒的试剂盒，所述类对虾东方病毒是指与对虾东方病毒同属的病毒。所述试剂盒是采用核酸扩增方法进行检测试剂盒或采用免疫反应进行检测的试剂盒。进一步的，所述试剂盒是采用核酸扩增技术进行检测试剂盒。由于东方病毒是一种单链RNA病毒，基因组RNA的合成直接由其依赖于RNA的RNA聚合酶进行复制，在RNA复制过程中，依赖于RNA的RNA聚合酶缺乏3’-5’的纠错功能，导致基因组在自然复制时容易发生突变，基因组的整体或部分特异性序列的片段内可能存在≥70％的变异，因此在检测时，还需针对≥70％同源序列具有检测能力。上述试剂盒以(a)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的RNA序列或相应的DNA序列全部或部分片段；或(b)(a)的互补序列；或(c)(a)或(b)的70％或以上同源的序列为特异性序列。上述特异性序列长度优选为12-3000nt；更优选的，长度为30nt-1200nt；最优选的，长度为40nt-600nt。所述试剂盒包含1对或1对以上的成对引物。所述试剂盒的引物可以是检测序列的特异性序列或含简并碱基的序列，还可以是包含锁核酸的序列。为了对≥70％同源的特异性序列进行检测时，最简单的方式是将存在单核苷酸多样性的突变位点视为相应的碱基的简并位点，从而可用包含多种突变碱基的简并碱基的序列作为引物序列；对于这种简并方式也可用次黄嘌呤或其他等效碱基代替。所述引物的长度为9nt-45nt；优选的，长度为15nt-30nt；更优选的，长度为18nt-25nt。进一步的，所述引物选自如SEQIDNO:4-SEQIDNO:26所示的任意2条或2条以上的正向和反向互补序列序列，或者2条之间的SEQIDNO:1的特异性序列或其反向互补的特异性序列；或如SEQIDNO:27-SEQIDNO:34所示的任意2条或2条以上的正向和反向互补序列，或者2条之间的SEQIDNO:2的特异性序列或其反向互补的特异性序列；或如SEQIDNO:35-SEQIDNO:40所示的任意2条或2条以上的正向和反向互补序列序列，或者2条之间的SEQIDNO:3的特异性序列或其反向互补的特异性序列。当包含1对引物时，可采用常规PCR检测、SYBRGreenI染色的实时荧光定量PCR检测、数字PCR检测或依赖于解旋酶的等温扩增(HDA)检测。当包含1对以上引物时，可采用套式PCR或多重PCR检测，套式PCR采用2对嵌套的引物，其中外侧的1对引物作为套式PCR的外引物用于第一步扩增，内侧的1对引物作为套式PCR的内引物用于第二步扩增；多重PCR采用2对或更多对相互独立的引物，对多个位点或不同基因型的对虾东方病毒或其变异体进行检测。还可以按照环介导的等温扩增(LAMP)引物的设计要求，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于对虾东方病毒（

【技术特征摘要】
1.一种基于对虾东方病毒（Orientaviruspenaei）基因组序列的检测方法及其应用，其特征在于，该病毒的保藏编号为CCTCCNo.V201864。2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，其基因组序列如SEQIDNo1、SEQIDNo2和SEQIDNo3所示。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该检测方法的特异性序列是在（a）：SEQIDNo1或SEQIDNo2或SEQIDNo3的RNA序列；或（b）：（a）转换的DNA序列；或（c）：（a）和（b）的≥70%同源的RNA或DNA序列；或（d）：包含（a）、（b）或（c）的简并碱基的RNA或DNA序列；或（e）：用次黄嘌呤或其他等效碱基代替的（d）的简并碱基的RNA或DNA序列；或（f）：与（a）或（b）或（c）或（d）或（e）互补的RNA和DNA序列；范围之内的1条或1条以上的12nt-3000nt的片段。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，该方法至少包括1对从特异性序列中选择12nt-30nt的单链DNA或RNA片段为特异性引物。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的特异性引物选择自SEQIDNo4-SEQIDNo40所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：董宣，黄倢，曹志，张庆利，史卫峰，胡弢，李晨，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37