一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合、探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合、探针、试剂盒及方法，属于转基因产品检测技术领域。本发明专利技术针对转基因玉米MON87419品系特异性序列设计得到引物组合MON87419‑F、MON87419‑R和TaqMan探针MON87419‑P，同时还建立了实时荧光聚合酶链式反应检测方法。利用该检测引物和检测探针及建立的实时荧光PCR体系，按照本发明专利技术的方法定量下限为30拷贝，建立的标准曲线线性相关系数(R

【技术实现步骤摘要】
一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合、探针、试剂盒及方法
本专利技术属于转基因产品检测
，具体涉及一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合、探针、试剂盒及方法。
技术介绍
转基因玉米MON87419为孟山都公司开发的耐麦草畏(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸钠)和草铵膦(2-氨基-4-(羟基甲基磷酰)氨基丁酸)除草剂品系。MON87419含嗜麦芽窄食单胞菌的demethylasegene去甲基化酶基因，表达麦草畏单加氧酶基因(DMO)蛋白，具有抗麦草畏除草剂能力；含产绿色链霉菌N-乙酰基转移酶(PAT)基因，表达草丁膦乙酰基转移酶(PAT)蛋白，具有抗草铵膦除草剂能力。2016年上市，目前获得批准的国家有澳大利(食品)、新西兰(食品)、加拿大(食品和饲料及种植)、日本(食品)、韩国(食品)和美国(食品、饲料及种植)6个国家。MON87419由农杆菌介导含2个T-DNA的质粒PV-ZMHT507801入玉米基因组研发而成。T-DNAI含dmo基因表达盒和pat基因表达盒，T-DNAII含cp4epsps表达盒用于筛选。两个T-DNA均插入玉米基因组中，随后进行传统的育种、分离、筛选含有dmo基因表达盒和pat基因表达盒而无cp4epsps表达盒的植株作为MON87419品系。目前对转基因产品，多数国家均采用相应的标识管理制度，品系特异性PCR(转化事件特异性)(Event-specificPCR)检测的目标序列是外源插入序列与植物基因组间连接区，相较于筛选PCR(ScreeningPCR)、基因特异性PCR(Gene-specificPCR)、构建特异性PCR(Construct-specificPCR)具有更加高的具有高特异性，能用于检测鉴定相同质粒转化的转基因具体品系，是目前转基因品系鉴定检测技术研究和实际检测工作中的重要方法。为打破其他国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，完善我国转基因产品定量检测技术体系，保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，为进出境口岸监管部门提供转基因不同品系标识检测鉴定的方法，建立转基因玉米MON87419品系特异性定量PCR精准检测方法十分必要。
技术实现思路
有鉴于
技术介绍
中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合、探针、试剂盒及方法。本专利技术提供了一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合，所述引物组合包括上游引物MON87419-F和下游引物MON87419-R；所述上游引物MON87419-F的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示；所述下游引物MON87419-R的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示。本专利技术提供了一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的探针，所述探针为探针MON87419-P；所述探针MON87419-P的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示。本专利技术提供了一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组合。优选的，所述试剂盒还包括上述探针。优选的，所述试剂盒还包括PremixExTaqTM，ROXReferenceDyeⅡ和双蒸水。本专利技术提供了一种转基因玉米MON87419品系特异性实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：(1)提取样品DNA，得到扩增模板；(2)将所述扩增模板、上游引物MON87419-F、下游引物MON87419-R、探针MON87419-P、PremixExTaqTM、ROXReferenceDyeⅡ和双蒸水配制成扩增反应体系；(3)用所述扩增反应体系进行实时荧光PCR反应，得到扩增曲线；根据扩增曲线判断样品是否为转基因玉米MON87419品系。优选的，所述步骤(2)扩增反应体系为25μL体系：PremixExTaqTM12.5μL，ROXReferenceDyeⅡ0.2μL，10μmol/L上游引物MON87419-F0.4μL，10μmol/L下游引物MON87419-R0.4μL，10μmol/L探针MON87419-P0.8μL，DNA模板2μL和双蒸水8.7μL。优选的，所述步骤(3)实时荧光PCR反应的反应程序为：95℃30s；95℃5s、58℃34s，40个循环；于58℃收集荧光信号。优选的，所述步骤(3)的根据扩增曲线判断样品是否为转基因玉米MON87419品系的标准为：40个循环内，如果有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因玉米MON87419品系；40个循环内，如果无典型荧光扩增曲线，则说明样品非转基因玉米MON87419品系。本专利技术还提供了一种转基因玉米MON87419品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，包括以下步骤：①提取转基因玉米MON87419的DNA，梯度稀释，得到不同起始浓度的扩增模板；②将所述扩增模板、上游引物MON87419-F、下游引物MON87419-R、探针MON87419-P、PremixExTaqTM、ROXReferenceDyeⅡ和双蒸水配制成扩增反应体系；用所述扩增反应体系进行实时荧光PCR反应，得到不同起始浓度扩增模板对应的Ct值。③所述Ct值与起始浓度的对数呈线性关系，根据步骤②得到的数据，构建转基因玉米MON87419品系的标准曲线公式；④提取待测样品的DNA为扩增模板，按步骤②所述方法进行反应，得到待测样品Ct值，将所述待测样品Ct值代入步骤③所述标准曲线公式，计算得到待检样品中转基因玉米MON87419品系的含量。有益效果：本专利技术针对转基因玉米MON87419品系特异性序列设计得到引物组合MON87419-F、MON87419-R和TaqMan探针MON87419-P，建立了转基因玉米MON87419实时荧光聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)检测方法。利用该检测引物和检测探针及建立的实时荧光PCR体系，按照本专利技术的方法定量下限为30拷贝，建立的标准曲线线性相关系数(R2)为0.99，扩增效率E为104％，重复性实验显示本专利技术的方法的标准偏差(SD)及相对标准偏差(RSD)都在可接受范围内，特异性良好、灵敏度高、稳定性强。本专利技术提供的引物组合、探针、试剂盒及方法打破了国外其他国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒；有助于弥补和完善我国转基因产品定量检测技术体系。本专利技术提供的技术用于转基因产品的检测，可更好的保护消费者的知情权和选择权，满足国家监管部门对转基因产品的鉴定和标识需求。附图说明图1为体系退火温度为58℃时扩增图，从左到右依次代表引物探针配比A(MON87419-F/R/P：0.5μL/0.5μL/1μL)、B(MON87419-F/R/P：0.4μL/0.4μL/0.8μL)和C(MON87419-F/R/P：0.2μL/0.2μL/4μL)；图2为体系退火温度为60℃时扩增图，从左到右依次代表引物探针配比A(MON87419-F/R/P：0.5μL/0.5μL/1μL)、B(MON87419-F/R/P：0.4μL/0.4μL/0.8μL)和C(MON87419-F/R/P：0.2μL/0.2μL/4μL)；图3为转基因玉米MON87419品系特异性检测方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括上游引物MON87419‑F和下游引物MON87419‑R；所述上游引物MON87419‑F的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；所述下游引物MON87419‑R的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括上游引物MON87419-F和下游引物MON87419-R；所述上游引物MON87419-F的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示；所述下游引物MON87419-R的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示。2.一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的探针，其特征在于，所述探针为探针MON87419-P；所述探针MON87419-P的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示。3.一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括权利要求2或3所述的探针。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括PremixExTaqTM，ROXReferenceDyeⅡ和双蒸水。6.一种转基因玉米MON87419品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取样品DNA，得到扩增模板；(2)将所述扩增模板、权利要求1所述的上游引物MON87419-F和下游引物MON87419-R、权利要求2所述的探针MON87419-P、PremixExTaqTM、ROXReferenceDyeⅡ和双蒸水配制成扩增反应体系；(3)用所述扩增反应体系进行实时荧光PCR反应，得到扩增曲线；根据扩增曲线判断样品是否为转基因玉米MON87419品系。7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)扩增反应体系为25μL体系：PremixExTaqTM12.5μL，ROXReferenceDyeⅡ0.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘二龙，卢丽，吕英姿，蒋湘，李嘉琪，夏柔菲，
申请(专利权)人：黄埔出入境检验检疫局综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：广东,44