本发明专利技术提供了一种与广谱抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的SNP分子标记K_060502，该SNP标记检测水稻第6号染色体第10432612位点处碱基为G或T，基于KASP技术开发的该SNP标记的引物组合为Primer X、Primer Y和Primer C。本发明专利技术利用KASP技术对与广谱抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的SNP标记进行基因快速分型，可以高、中、低通量的应用在商业化分子育种中；同时开发SNP标记表型的选择效率达到100％，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测广谱抗稻瘟基因Pi2；并且在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少了气溶胶的污染以及溴化乙锭EB(ethidium bromide)等有毒物的使用，可在育种早期进行前景的分子标记辅助选择，减小育种群体的大田种植规模，降低育种成本，加快育种进程。
【技术实现步骤摘要】
水稻抗稻瘟病基因Pi2的SNP标记的开发和应用
本专利技术涉及分子标记及作物育种领域，具体的，涉及一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的SNP标记的开发和应用。
技术介绍
水稻是中国乃至世界上最重要的粮食作物之一，世界上有一半以上的人口以稻米为主食。稻瘟病被称为水稻的癌症，是对水稻生产危害最严重的病害之一。中国大面积推广的杂交稻，由于缺少远源优质抗病资源的导入，亲本遗传多样性不高，抗病改良是一大瓶颈；在水稻主要种植国家，经常有稻瘟病流行和爆发的报道，每年可造成20-100％的产量损失。实践证明，选育抗病品种是解决上述问题最为经济、安全、环保、高效的方法。但由于稻瘟菌生理小种致病性变异频繁、群体结构复杂，导致单一抗性品种在种植3～5年后即丧失抗性，因此利用广谱抗病基因培育持久、广谱抗病品种是应对稻瘟病危害的重要途径。至今，水稻中有25个已克隆的稻瘟病抗性基因，其中大多数抗谱很窄。而来自哥伦比亚籼稻品种5173的Pi2，是一个显性广谱抗稻瘟病基因。Chen等以来源于中国中部和南部稻区的792个生理小种接种携带Pi2基因的水稻近等基因系C101A51，发现C101A51对超过92％的生理小种表现抗性；Liu等研究表明，C101A51对来自13个国家的43个稻瘟菌生理小种中的36个表现抗性；刘士平用不同地区来源的75个稻瘟菌菌株接种发现，Pi2抗谱高达85.53％。因此，Pi2在水稻抗稻瘟病育种中具有重要应用价值，自2006年克隆以来，得到了广泛应用。与传统育种方法相比，分子标记辅助选择提高了选择的可靠性，加快了育种进度，且不受环境和人员经验影响，近年来越来越多的应用到育种实践中。但Pi2所在的基因簇内，至少存在10个抗病基因(Piz,Piz-t,Pi2,Pi2,Pi9,Pi25,Pi26,Pi40,Pi50,Pi2-2)，它们在序列上高度相似，核苷酸水平上的序列一致性达95.6％；在氨基酸水平上，Pi2与Pi9序列一致性高达96％，Pi2与Piz-t只有8个氨基酸的差异。因此，需要开发一种稳定、可靠、分辨率高的分子标记。目前已开发的分子标记，一般都需要进行琼脂糖凝胶电泳(邓国富等，CN105462971B；张明永等，CN106636358A)，甚至需要更复杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳(陈庆全等，CN102312000A；陈松彪等，CN104073487B；纪剑辉等，CN104450932B；圣中华等，CN106636395A)，有的还需要酶切后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(华丽霞等，CN103320437B)，操作繁琐，费时耗物，不便于规模化鉴定；金名捺等(CN107435068A)通过高分辨率熔解曲线分析(HighResolutionMeltingCurveAnalysis，HRM)的方法检测SNP(SingleNucleotidePolymorphism)位点，虽然避免了电泳或酶切过程，但随着扩增产物片段增大，检测的准确性和稳定性会逐渐降低。因此，需要开发的标记除了稳定可靠、分辨率高，还要操作简便、高效快速、可直接对碱基进行检测。
技术实现思路
本专利技术公开了一种稻瘟病抗性基因Pi2的分子标记和应用，所述分子标记是与广谱抗稻瘟病基因Pi2连锁的SNP标记。该标记基于KASP技术开发，能精确的将Pi2与其它紧密连锁或等位的抗稻瘟病基因进行区分，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定性好等优点，且能在低世代群体中准确检测Pi2，提高育种效率，缩短育种年限，对水稻稻瘟病抗性育种具有重要意义。具体的，本专利技术所述的一种稻瘟病广谱抗性基因Pi2的分子标记的开发流程见图1。根据文献资料将水稻Pi2基因定位于水稻6号染色体的10387509-10390465区间，对此基因区间及其附近两侧的SNP位点进行挖掘。挑选出的SNP位点，提取其侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3对其进行引物设计。利用候选SNP标记，对含有Pi2基因的供体材料C101A51和其它不含Pi2基因的22个水稻品种进行KASP反应验证，挑选出与Pi2供体材料共分离及扩增效果好的的SNP标记K_060502。利用K_060502标记对190份材料进行检测，证实本专利技术所检测的Pi2基因位点为高特异性的抗性位点。利用标记K_060502对Pi2供体亲本C101A51和黄华占杂交产生的F2遗传分离群体进行检测，结合抗性鉴定数据，再次验证了本专利技术的可行性和准确性。为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供与稻瘟病抗性基因Pi2紧密连锁的SNP(singlenucleotidepolymorphism)分子标记K_060502及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：一种与抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的SNP分子标记，所述分子标记是与抗稻瘟病基因Pi2共分离的SNP标记K_060502，该SNP标记检测水稻第6号染色体第10432612位点处碱基为G或T；一种用于检测权利要求1所述分子标记的引物组合包括：(1)两条特异性引物：PrimerX：5’-GAGCTTCAGCAAGCCATC-3’；PrimerY：5’-TGAGCTTCAGCAAGCCATA--3’；(2)一条通用引物：PrimerC：5’-GATATTGTTTCTCTGCCATGC-3’，具体见表1。表1标记序列表标记名称AlleleXAlleleYPositionPrimerSeqAlleleXPrimerSeqAlleleYPrimerSeqCommonK_060502GTchr6.10432612GAGCTTCAGCAAGCCATCTGAGCTTCAGCAAGCCATAGATATTGTTTCTCTGCCATGC一种检测抗稻瘟病基因Pi2的SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组合。所述分子标记、所述的引物组合或所述试剂盒在检测抗稻瘟病基因Pi2、在抗稻瘟病基因Pi2辅助育种以及在选育抗稻瘟病的水稻资源中的应用。进一步的，所述应用包括利用KASP进行Pi2分型或是将Pi2锚定在基因芯片中。更进一步的，包括如下步骤：S1、提取水稻样品基因组DNA；S2、以水稻基因组DNA为模板，利用上述引物组合进行KASP反应检测；其中，两条特异性引物分别连接不同的荧光序列；S3、若只检测到引物PrimerX所连荧光序列对应的荧光信号，则检测位点为碱基G，判断水稻样品为携带抗稻瘟病基因Pi2的纯和型；若只检测到引物PrimerY所连荧光序列对应的荧光信号，则检测位点为碱基T，判断水稻样品为不含抗稻瘟病基因Pi2的纯和型；若同时检测到两种荧光，则判断水稻样品为抗稻瘟病基因Pi2的杂合型。进一步的，特异性引物5’段连接FAM或HEX荧光接头序列。再进一步的，所述分子标记在水稻抗病性辅助育种中的应用，包括如下步骤：S1、提取水稻样品基因组DNA；S2、以水稻基因组DNA为模板，利用上述引物组合进行KASP反应检测；其中，两条特异性引物分别连接不同的荧光序列；S3、选择检测到引物PrimerX所连荧光序列对应的荧光信号的水稻样品进行育种。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术开发的SNP标记与Pi2基因紧密连锁，经过分离群体稻瘟病表型鉴定后，验证开发的SNP标记表型选择效率达到100％，可在籼稻、粳稻本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种与抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记是与抗稻瘟病基因Pi2共分离的SNP标记K_060502，该SNP标记检测水稻第6号染色体第10432612位点处碱基为G或T。
【技术特征摘要】
1.一种与抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记是与抗稻瘟病基因Pi2共分离的SNP标记K_060502，该SNP标记检测水稻第6号染色体第10432612位点处碱基为G或T。2.一种用于检测权利要求1所述分子标记的引物组合包括：(1)两条特异性引物：PrimerX：5’-GAGCTTCAGCAAGCCATC-3’；PrimerY：5’-TGAGCTTCAGCAAGCCATA-3’；(2)一条通用引物：PrimerC：5’-GATATTGTTTCTCTGCCATGC-3’。3.权利要求1所述分子标记在检测抗稻瘟病基因Pi2中的应用。4.权利要求1所述分子标记在抗稻瘟病基因Pi2辅助育种中的应用。5.权利要求1所述分子标记在选育抗稻瘟病的水稻资源中的应用。6.根据权利要求6所述的选育抗稻瘟病的水稻资源中的应用，其特征在于，所述应用为利用KASP进行Pi2分型或是将Pi2锚定在基因芯片中。7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：S1、提取水稻样品基因组DNA；S2、以水稻基因组DNA为模板...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭佩，石彦龙，江南，李为国，肖金华，
申请(专利权)人：华智水稻生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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