水稻广谱抗稻瘟病基因Pigm的SNP标记开发和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种与抗稻瘟病基因Pigm紧密连锁的SNP分子标记K_060508，该SNP标记检测水稻第6号染色体的第10421726位点处碱基为G或A，基于KASP技术开发的该SNP标记的引物组合为Primer X、Primer Y和Primer C。本发明专利技术利用KASP技术对与抗稻瘟病基因Pigm紧密连锁的SNP标记进行基因快速分型，可以高、中、低通量的应用在商业化分子育种中；同时开发SNP标记表型的选择效率达到100％，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测广谱抗稻瘟病基因Pigm；并且在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少了气溶胶的污染以及EB(ethidium bromide)等有毒物的使用，可在育种早期进行前景的分子标记辅助选择，减小育种群体的大田种植规模，降低育种成本，加快育种进程。

【技术实现步骤摘要】
水稻广谱抗稻瘟病基因Pigm的SNP标记开发和应用
本专利技术涉及分子标记及作物育种领域，具体的，涉及水稻广谱抗稻瘟病基因Pigm的SNP标记开发和应用。
技术介绍
由稻瘟病菌(Magnapotheoryzae)引起的稻瘟病是一种世界性的稻作病害，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失可达11％～30％，长期实践表明，培育抗病品种(系)是目前防治稻瘟病最经济有效的措施。近几十年来，随着分子遗传学的发展，分子标记辅助选择在水稻抗病育种中发挥着举足轻重的作用，利用高效的分子标记辅助选择含有目标基因的单株进行杂交，能够精准进行目标性状的选育，且能减小选育群体大田种植规模，缩短育种年限，节约育种成本。目前，通过遗传分析，在水稻中已经鉴定命名了约100个稻瘟病抗性基因，其中26个已经成功克隆(Liuetal.,2014)。Pigm基因与水稻叶瘟抗性相关，是广谱抗瘟基因，比公认的广谱抗性基因Pi1、Pi2、Pi3的抗谱更广，其供体谷梅4号对收集自不同地区和国家的30个强致病菌株中的29个表现高抗或免疫。Pigm定位在水稻第6号染色体标记C5483和C0428间70Kb区间内，与标记S29742、C24901、PC22705共分离，包含13个NBS-LRR类抗病基因的基因簇(Dengetal.,2006)，其中2个具有功能的为蛋白PigmR和PigmS。PigmS可以与PigmR竞争形成异源二聚体抑制PigmR介导的广谱抗病性，减小病原菌的进化选择压力，减缓了病原菌对PigmR的致病性进化，因此Pigm介导的抗病具有持久广谱性，是较为有潜力的稻瘟病抗性基因(Dengetal.,2017)。此外，Pigm位于Pi2/9位点上，与Pi2、Pi9、Pi-zt、Piz、Pi50互为复等位基因，但是各自的基因序列及抗谱存在一定差异，要实现对Pigm的利用就需要精准的将Pigm与其它复等位基因区分开来。但目前检测Pigm所用的分子标记多为SSR、InDel或CAPS标记，这些标记不能有效将Pigm与其它复等位基因进行区分，且不能完全区分Pigm的供体和受体，检测结果易引起误判。此外，SSR、InDel或CAPS等标记的检测过程需要酶切、凝胶电泳等步骤，操作复杂，实验成本高，检测通量小，易对环境造成污染、对人体产生危害。开发Pigm特异性SNP分子标记及建立高通量、环保的检测体系，对促进Pigm在商业化育种中的应用具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术公开了一种水稻广谱抗稻瘟病基因Pigm的分子标记及应用，所述分子标记是与广谱抗稻瘟基因Pigm紧密连锁的SNP标记，该标记基于KASP技术开发，可高通量检测水稻品种日本晴基因组第6号染色体的第10421726位碱基。本专利技术应用KASP技术对SNP分子标记进行基因分型，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定性好等优点，能精确的将Pigm与其他紧密连锁或等位的抗稻瘟病基因进行区分，且能在低世代群体中准确检测Pigm，提高育种效率，缩短育种年限，对改良水稻稻瘟病的抗性具有重要意义。具体的，本专利技术所述的一种稻瘟病抗性基因Pigm的分子标记的开发流程见图1。据文献报道，Pigm基因位于水稻6号染色体的10387509-10390465区间，对此基因区间及其附近两侧的SNP位点进行发掘。挑选出的SNP位点，提取侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3对其进行引物设计。针对这些候选SNP标记，对Pigm基因供体材料谷梅4号和其它不含Pigm的22个水稻品种进行KASP反应验证，挑选出与Pigm供体材料共分离且扩增效果好的的SNP标记K_060508。我们利用约190份材料对所挑选的抗性基因连锁SNP标记进行自然群体验证，证明本专利技术检测的Pigm基因位点为高特异性的抗性位点。利用Pigm供体亲本谷梅4号和CO39杂交产生的群体后代进行了表型验证，再次验证了本专利技术的可行性和准确性。为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供与稻瘟病抗性基因Pigm紧密连锁的SNP(singlenucleotidepolymorphism)分子标记K_060508及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：一种与抗稻瘟病基因Pigm紧密连锁的SNP分子标记，所述分子标记是与抗稻瘟病基因Pigm共分离的SNP标记K_060508，该SNP标记检测水稻第6号染色体的第10421726位点处碱基为G或A；一种用于检测权利要求1所述分子标记的引物组合包括：(1)两条特异性引物：PrimerX：5’-CCAAGCAAATTACCACAACG-3’；PrimerY：5’-CCAAGCAAATTACCACAACAGC-3’；(2)一条通用引物：PrimerC：5’-TTGTTATACGGTTTAATTAAGGTGA-3’，具体见表1。表1标记序列表一种检测抗稻瘟病基因Pigm的SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括如上述的引物组合。所述分子标记在检测抗稻瘟病基因Pigm、在抗稻瘟病基因Pigm辅助育种以及在选育抗稻瘟病的水稻资源中的应用。进一步的，所述应用包括利用KASP进行Pigm分型或是将Pigm锚定在基因芯片中。更进一步的，包括如下步骤：S1、提取水稻样品基因组DNA；S2、以水稻基因组DNA为模板，利用上述引物组合进行KASP反应检测；其中，两条特异性引物分别连接不同的荧光序列；S3、若只检测到引物PrimerY所连荧光序列对应的荧光信号，则检测位点为碱基A，判断水稻样品为携带抗稻瘟病基因Pigm的纯和型；若只检测到引物PrimerX所连荧光序列对应的荧光信号，则检测位点为碱基G，判断水稻样品为不含抗稻瘟病基因Pigm的纯和型；若同时检测到两种荧光，则判断水稻样品为抗稻瘟病基因Pigm的杂合型。进一步的，特异性引物5’段连接FAM或HEX荧光接头序列。再进一步的，所述分子标记在水稻抗病性辅助育种中的应用，包括如下步骤：S1、提取水稻样品基因组DNA；S2、以水稻基因组DNA为模板，利用上述引物组合进行KASP反应检测；其中，两条特异性引物分别连接不同的荧光序列；S3、选择检测到引物PrimerY所连荧光序列对应的荧光信号的水稻样品进行育种。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术开发的SNP标记与Pigm基因紧密连锁，经过分离群体稻瘟病表型鉴定后，验证开发的SNP标记表型选择效率达到100％，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测广谱抗稻瘟病基因Pigm。(2)本专利技术开发的SNP标记结合KASP基因分型技术，可以高、中、低通量的应用在商业化分子育种中，且在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少了气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，直接对碱基进行检测，准确性不受扩增片段长度影响，而且简便、快速、精确，自动化程度高，大大提高了基因选育效率，降低了成本。(3)本专利技术所述的SNP标记可在苗期即可进行前景选择和背景选择，减小育种群体的大田种植规模，缩短育种年限，加快育种进程。附图说明图1为本发抗稻瘟病基因Pigm分子标记的开发流程图。图2为利用分子标记K_060508检测自然群体分型图。具体实施方式下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与抗稻瘟病基因Pigm紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记是与抗稻瘟病基因Pigm共分离的SNP标记K_060508，该SNP标记检测水稻第6号染色体的第10421726位点处碱基为G或A。

【技术特征摘要】
1.一种与抗稻瘟病基因Pigm紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记是与抗稻瘟病基因Pigm共分离的SNP标记K_060508，该SNP标记检测水稻第6号染色体的第10421726位点处碱基为G或A。2.一种用于检测权利要求1所述分子标记的引物组合包括：(1)两条特异性引物：PrimerX：5’-CCAAGCAAATTACCACAACG-3’；PrimerY：5’-CCAAGCAAATTACCACAACA-3’；(2)一条通用引物：PrimerC：5’-TTGTTATACGGTTTAATTAAGGTGA-3’。3.权利要求1所述分子标记检测抗稻瘟病基因Pigm中的应用。4.权利要求1所述分子标记在抗稻瘟病基因Pigm辅助育种中的应用。5.权利要求1所述分子标记在选育抗稻瘟病的水稻资源中的应用。6.根据权利要求5所述的选育抗稻瘟病的水稻资源中的应用，其特征在于，所述应用包括利用KASP进行Pigm分型或是将Pigm锚定在基因芯片中。7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：S1、提取水稻样品基因组DNA；S2、以水稻基因组D...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭佩，江南，李为国，梁毅，肖金华，
申请(专利权)人：华智水稻生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43