一种检测牛巴贝斯虫的引物组、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种交叉引物恒温扩增‑免疫层析联合检测牛巴贝斯虫的引物组、探针及试剂盒。本发明专利技术的牛巴贝斯虫的鉴别检测试剂盒包括用于恒温扩增的一条交叉引物Bbovis‑2a1s、一对置换引物Bbovis‑5a和Bbovis‑4s、FITC标记的探针引物Bbovis‑2a和生物素标记的探针引物Bbovis‑3a、扩增所需常规试剂以及侧流层析试纸条。本发明专利技术所述检测方法能够特异性检测牛巴贝斯虫，不需要复杂仪器设备、结果直观可见，适合基层现场临床样品的快速检测和流行病学调查。

【技术实现步骤摘要】
一种检测牛巴贝斯虫的引物组、探针及试剂盒
本专利技术涉及一种交叉引物恒温扩增结合免疫层析法进行牛巴贝斯虫检测的引物组、探针与试剂盒，确切讲本专利技术涉及一种牛巴贝斯虫病检测试剂盒及非疾病诊断方法。
技术介绍
牛巴贝斯虫病(ovisBabesiosis)是由巴贝斯属的原虫寄生于黄牛、水牛的红细胞内所引起的一种急性、热性、季节性的蜱传性血液原虫病，以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿为主要临床特征，严重时引起死亡。本病在世界范围内广泛流行，给畜牧业带来了严重的危害，我国将其列为二类动物疫病。在我国，已报道的感染牛的巴贝斯虫病原有五种，包括牛巴贝斯虫(Babeisabovis)、双芽巴贝斯虫(Babeisabigemina)、卵形巴贝斯虫(Babeisaovata)、大巴贝斯虫(Babeisamajor)和东方巴贝斯虫(Babeisaorientalis)。巴贝斯虫病在我国的流行范围极广，其中由牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的分为最为广泛，利用分子生物学和血清学方法对我国牛巴贝斯虫病的调查结果显示，牛巴贝斯虫的阳性率分别为6.3％-68.5％和1％-60％(吕伟等，2009；刘启生等，2013；袁利芹等，2014；李安岩等，2014；Niuetal，2015；Liuetal，2017)；双芽巴贝斯虫阳性率为9.3％-30.5％和1％-62.2％。临床上主要由牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫引发牛的巴贝斯虫病(刘钟灵等，1987；吕文祥等，1995；吕文顺等，1979；白启等，1990；白启等，1992；殷宏等，2000；deVosandPotgieter，2004)。一般地，牛巴贝斯虫引起的临床症状更为严重(Ristic,1981)。因此，建立一种快速、简便，适用于基层推广的检测方法，对于牛巴贝斯虫的现场检测和了解其流行情况具有更为现实的意义。进行巴贝斯虫的鉴别检测也是寄生虫学研究的重要内容，有益于针对性地预防和控制牛的巴贝斯虫病。形态学鉴定是牛巴贝斯虫病检测的经典方法，但是对于染虫率很低的情况下，很难检测到。此外，形态学鉴定对操作人员的素质要求很高，工作量较大，不适合进行大批量样品的检测和基层推广使用。基于免疫学和分子生物学发展而来的用于鉴别检测牛巴贝斯虫的方法有间接荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光定量PCR、多重PCR、反向线性印迹(RLB)。上述方法均具有灵敏度高、特异强的特点，但是间接荧光抗体、酶联免疫吸附试验、实时荧光定量PCR和多重PCR需要昂贵的仪器；反向线性印迹操作繁琐、耗时长。而且上述方法不利于现场快速检测的开展。因此，亟待开发一种快速、高灵敏度和特异性的可用于临床现场检测的可靠方法。交叉引物扩增是以具有置换活性的BstDNA聚合酶建立的一种恒温扩增检测技术，检测耗时短、特异性好、灵敏度高，整个检测过程只需要一台恒温水浴锅即可完成反应；结果的判定结合层析试纸条，以肉眼可见的方式完成。所以，特别适合有大量样品非实验室场所的临床检测和流行病学调查。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种牛巴贝斯虫鉴别检测的交叉引物恒温扩增结合免疫层析的方法和试剂盒，使牛巴贝斯虫的检测不依赖于昂贵的仪器设备，结果直观可见，适用于基层临床检测的广泛使用和流行病学调查。本专利技术的检测试剂盒中至少包括有交叉引物Bbovis-2a1s—SEQIDNo.3、一对置换引物Bbovis-5a—SEQIDNo.1和SEQIDNo.2—Bbovis-4s、FITC标记的探针引物Bbovis-2a—SEQIDNo.4和生物素标记的探针引物Bbovis-3a—SEQIDNo.5，以及核酸检测试纸条。本专利技术所用的免疫层析试纸条购自Twistdx公司。为方便使用，本专利技术的检测试剂盒还包括：10×IsothermalAmplificationBuffer、100mMMgSO4、2.5mMdNTPmix，BstDNA聚合酶和核酸检测试纸条。本专利技术的试剂盒还可有层析缓冲液。本专利技术的检测牛巴贝斯虫的试剂盒的非疾病检测使用方法包括以下步骤：(1)提取待检样品基因组DNA；(2)以提取的基因组DNA为模板，利用所述引物和探针建立的交叉引物恒温扩增反应体系和扩增条件进行扩增；(3)将扩增产物滴加至免疫层析试纸条进行显色检测，随后将试纸条置于含有100μL层析缓冲液的1.5mL离心管中，静置3-5min后，读取结果，当质控线和检测线均显色，则判定为阳性；若只有质控线处显色，则结果判定为阴性；如质控线不显色，则检测结果无效。本专利技术的具体方案包括以下内容：(1)交叉引物恒温扩增的引物组和探针：置换引物Bbovis-5a：5'-ATGGATAACCGCGCTAA-3'(SEQIDNo.1)置换引物Bbovis-4s：5'-GGTCAGAAACTTGAATGGA-3'(SEQIDNo.2)交叉引物Bbovis-2a1s：5'-TGTGGCTAATACACGTTTGGAGTCGCAGGTTACTGTAA-3'(SEQIDNo.3)探针引物Bbovis-2a：5'-FITC-TGTGGCTAATACACGTTTG-3'(SEQIDNo.4)探针引物Bbovis-3a：5'-Bio-GCGTTTACTGGTCTTGTGA-3'(SEQIDNo.5)(2)提取待检样品全血基因组DNA取待检黄牛、水牛全血200μL，利用血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA(试剂盒购自QIAGEN公司，货号51306)，操作方法参照说明书进行。(3)交叉引物扩增反应体系(4)扩增反应条件：优选地，所述交叉引物扩增反应条件为58～71℃，60min，85℃，2min。更优选地，所述交叉引物扩增反应条件为61℃，60min，85℃，2min。(5)结果检测优选地，层析试纸条检测方法：取恒温扩增产物10μL滴至试纸条的吸收垫上，随后将试纸条插入到含有100μL层析缓冲液的1.5mL离心管中，静置3～5min，判定检测结果。(6)检测结果判定当质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；当质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；当质控线不显色，本次检测不成立。本专利技术公布了一种交叉引物恒温扩增结合免疫层析技术用于牛巴贝斯虫鉴别检测的引物组、探针和试剂盒，与现有的方法项目具有下列优点：(1)操作简单易学、快速：对操作人员试验技能要求低，具备普通PCR操作技能的人员均可进行本操作；整个检测过程可在90min内全部完成。(2)特异性高：本专利技术中有两条标记探针Bbovis-2a、Bbovis-3a和一条交叉引物Bbovis-2a1s识别牛巴贝斯虫的特异序列区，保证了本方法的高度特异性。(3)灵敏度高：本专利技术所建立的方法可以检测25μL反应体系中大于0.32pg的牛巴贝斯虫基因组DNA，相当于50μL红细胞染虫率为0.000032％所提取的基因组DNA。(4)设备要求低：恒温扩增不需要昂贵的PCR仪或荧光定量PCR仪，只需要有提供恒温的装置即可，如水浴锅、恒温箱等均可完成本检测。(5)检测结果易于判读：扩增产物经试纸条显色后，以肉眼可见的方式来读取，不需要专门的仪器。附图说明图1.牛巴贝斯虫交叉引物恒温扩增最佳反应温度的筛选。1-5号试纸条反应温度分别为55℃、58℃、61℃、65℃、68℃。图2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测牛巴贝斯虫的试剂盒，其特征在于检测试剂盒中至少包括有一条交叉引物SEQ ID No.3、一对置换引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、FITC标记的探针引物SEQ ID No.4和生物素标记的探针引物SEQ ID No.5。

【技术特征摘要】
1.一种检测牛巴贝斯虫的试剂盒，其特征在于检测试剂盒中至少包括有一条交叉引物SEQIDNo.3、一对置换引物SEQIDNo.1和SEQIDNo.2、FITC标记的探针引物SEQIDNo.4和生物素标记的探针引物SEQIDNo.5。2.根据权利要求1所述的检测牛巴贝斯虫的试剂盒，其特征在于检测试剂盒中还包括：10×IsothermalAmplificationBuffer、100mMMgSO4、2.5mMdNTPmix，BstDNA聚合酶和核酸检测试纸条。3.根据权利要求2所述的检测牛巴贝斯虫的试剂盒，其特征在于盒内包括：10×IsothermalAmplificationBuffer2.5μL，100mMMgSO41.5μL，2.5mMdNTPmix8μL，BstDNA聚合酶8U，20μM交叉引物Bbovis-2a1s1.25μL，10μM置换引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：王锦明，关贵全，刘军龙，李有全，刘爱红，杨吉飞，刘志杰，殷宏，罗建勋，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62