不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术制造技术

本发明专利技术涉及不同类型致泻大肠埃希氏菌检测技术，具体公开了一种不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术。通过一次多管多通路的实时荧光定量PCR检测方法，同时在相同的热循环条件下快速的检测多个基因，实现不同类型致泻大肠埃希氏菌的鉴定，操作更加快捷，易于掌握，可直接通过荧光信号实时观测结果。

【技术实现步骤摘要】
不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术
本专利技术属于食品及其相关物品的微生物检测领域，涉及PCR技术，尤其是涉及不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术。
技术介绍
致泻大肠埃希氏菌(DiarrheagenicEscherichiacoli)是一类能引起腹泻为主的大肠埃希氏菌，可以经过污染的食物导致人体发病。常见的致泻大肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌(EnteropathogenicEscherichiacoli，EPEC)、肠道侵袭性大肠埃希氏菌(EnteroinvasiveEscherichiacoli，EIEC)、产肠毒素大肠埃希氏菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)、产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli，STEC)、及肠道集聚性大肠埃希氏菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli，EAEC)等，其中STEC包括肠道出血性大肠埃希氏菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)。不同种的致泻大肠埃希氏菌具有不同的特征基因，如表1所示：表1五种致泻大肠埃希氏菌特征基因目前大肠埃希氏菌的PCR确定试验，主要是取生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行多次的PCR确认试验，每个样品的初筛需要配置十余个PCR扩增反应体系，对应检测不同目标基因，同时该方法需凝胶电泳后通过查找不同目标条带种类及组合，确定大肠埃希氏菌种类，耗费人力并容易导致污染，因而有必要发展新的检测方法，实现对大肠埃希氏菌的快速诊断鉴定。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术，同时在相同的热循环条件下快速的检测多个基因。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：1)制备致泻大肠埃希氏菌，作为待检测样品模板；具体方式为使用1μL接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养18h～24h的菌落，悬浮在200μL0.85％灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，于13000r/min离心3min，弃掉上清液；加入1mL灭菌去离子水充分混匀菌体，于100℃水浴或者金属浴维持10min，冰浴冷却后，13000r/min离心3min，收集上清液；按1∶10的比例用灭菌去离子水稀释上清液，取2μL作为荧光定量PCR检测的模板；所有处理后的DNA模板直接用于荧光定量PCR反应或暂存于4℃并当天进行荧光定量PCR反应；否则，应在-20℃以下保存备用(1周内)；2)在包含上下游扩增引物、探针等的反应体系中进行多重荧光定量PCR扩增；每个样品2个荧光定量PCR反应体系，对应检测8个目标基因，2个反应体系的引物如下表：3)扩增过程中，配置好的反应体系置于荧光定量PCR仪器中，按照反应程序，荧光定量PCR仪自动采集扩增产物的荧光信号；反应体系25μL，配置方式如下：TaqManPCRMasterMix12.5μL上下游扩增引物各10pmol探针2pmol模板2.5μLddH2O补足至25μL将配置好的反应体系置于荧光定量PCR仪器中，扩增条件：第一阶段：95℃下预变性30s；第二阶段：40次循环：95℃变性5s，55℃退火20s，72℃收集荧光15s。在第二阶段的退火步骤结束时，收集记录发光信号。5)结果分析，测定样品基因检测有对应荧光增幅现象，且Ct值小于或等于36，则判定样品含有此荧光信号，根据体系1和体系2中的荧光信号判定致泻大肠埃希氏菌种类。产肠毒素大肠埃希氏菌：体系1中存在FAM、Cy5荧光信号一种或两种；肠道集聚性大肠埃希氏菌：体系1中存在ROX荧光信号；肠道侵袭性大肠埃希氏菌：体系2中存在FAM荧光信号；肠道致病性大肠埃希氏菌：体系2中存在ROX荧光信号；产志贺毒素大肠埃希氏菌/肠道出血性大肠埃希氏菌：体系2中存在Cy5荧光信号。具体实施方式：本专利技术提供的不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术，其确定过程如下：1.细菌株：肠道致病性大肠埃希氏菌(EnteropathogenicEscherichiacoli，EPEC)、肠道侵袭性大肠埃希氏菌(EnteroinvasiveEscherichiacoli，EIEC)、产肠毒素大肠埃希氏菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)、产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli，STEC)、及肠道集聚性大肠埃希氏菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli，EAEC)，其中STEC包括肠道出血性大肠埃希氏菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)。2.主要试剂与设备：2×HotStartTaqPCRMasterMix；LightCycle480荧光定量PCR仪等3.菌群的扩增方法如下：使用1μL接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养18h～24h的菌落，悬浮在200μL0.85％灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，于13000r/min离心3min，弃掉上清液。加入1mL灭菌去离子水充分混匀菌体，于100℃水浴或者金属浴维持10min，冰浴冷却后，13000r/min离心3min，收集上清液；按1∶10的比例用灭菌去离子水稀释上清液，取2μL作为荧光定量PCR检测的模板；所有处理后的DNA模板直接用于荧光定量PCR反应或暂存于4℃并当天进行荧光定量PCR反应。4.阴性对照、空白对照的设计：以非致泻性大肠埃希氏菌为阴性对照，以ddH2O为空白对照。5.实时荧光定量PCR反应体系如下，每个样品做2个平行对照，加样时应使DNA溶液完全加入体系中，不要黏附于管壁：TaqManPCRMasterMix12.5μL上下游扩增引物各10pmol探针2pmol模板2.5μL水补足至25μL6.仪器设置：设定样品名称、对应的荧光基团和淬灭基团的种类、荧光信号收集等，设置PCR反应参数。7.PCR反应运行：按照预先设置的样品摆放顺序，将PCR反应管依次摆放，并运行反应程序。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术，包括如下步骤：1)制备致泻大肠埃希氏菌，作为待检测样品模板；具体方式为使用1μL接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养18h～24h的菌落，悬浮在200μL 0.85％灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，于13000r/min离心3min，弃掉上清液；加入1mL灭菌去离子水充分混匀菌体，于100℃水浴或者金属浴维持10min，冰浴冷却后，13000r/min离心3min，收集上清液；按1∶10的比例用灭菌去离子水稀释上清液，取2μL作为荧光定量PCR检测的模板；所有处理后的DNA模板直接用于荧光定量PCR反应或暂存于4℃并当天进行荧光定量PCR反应；否则，应在‑20℃以下保存备用(1周内)；2)在包含上下游扩增引物、探针等的反应体系中进行多重荧光定量PCR扩增；每个样品2个荧光定量PCR反应体系，对应检测8个目标基因，2个反应体系的引物如下表：

【技术特征摘要】
1.不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量PCR检测技术，包括如下步骤：1)制备致泻大肠埃希氏菌，作为待检测样品模板；具体方式为使用1μL接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养18h～24h的菌落，悬浮在200μL0.85％灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，于13000r/min离心3min，弃掉上清液；加入1mL灭菌去离子水充分混匀菌体，于100℃水浴或者金属浴维持10min，冰浴冷却后，13000r/min离心3min，收集上清液；按1∶10的比例用灭菌去离子水稀释上清液，取2μL作为荧光定量PCR检测的模板；所有处理后的DNA模板直接用于荧光定量PCR反应或暂存于4℃并当天进行荧光定量PCR反应；否则，应在-20℃以下保存备用(1周内)；2)在包含上下游扩增引物、探针等的反应体系中进行多重荧光定量PCR扩增；每个样品2个荧光定量PCR反应体系，对应检测8个目标基因，2个反应体系的引物如下表：3)扩增过程中，配置好的反应体系置于荧光定量PCR仪器中，按照反应程序，荧光定量PCR仪自动采集扩增产物的荧光信号；4)结果分析，测定样品基因检测有对应荧光增幅现象，且Ct值小于或等于36，则判定样品含有此荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙兆增，
申请(专利权)人：谱尼测试集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11