用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记和方法、引物组合物、试剂盒和应用技术

本发明专利技术提供了一种用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记和方法、引物组合物、试剂盒和应用，涉及菌种鉴别技术领域。该SNP分子标记共包含17个SNP位点，分布于Hsp65基因、rrs基因和pncA基因，上述SNP分子标记在结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌中具有多态性。上述引物组合物可以扩增Hsp65基因、rrs基因和pncA基因，以用于后续SNP分子标记的分析以及菌种的鉴别。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记和方法、引物组合物、试剂盒和应用
本专利技术涉及菌种鉴别
，尤其是涉及一种用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记和方法、引物组合物、试剂盒和应用。
技术介绍
结核病是最严重的流行性传染疾病之一，使人类的公共健康面临着巨大的挑战。它在全世界范围内有着相当高的致病率和致死率。传统的鉴别结核分枝杆菌菌种的方法是根据菌落形态、氧偏好性、烟酸累积、硝酸盐还原酶的活性以及生长动力学等的表型特征来判断，这些方法都制约于缓慢的细菌培养，而且涉及主观解读易于判错。目前常见的分子生物学进行菌种鉴别的方法主要根据测定插入序列16srRNA的碱基差异来判断的，即使是采用测定16srRNA基因序列的方法也无法的区分上述数十种分枝杆菌。因此快速鉴别分枝杆菌中的成员，对于控制传染源和早期治疗起着至关重要的作用，也可为临床治疗提供用药指导。现今的分子鉴别方法主要有IS6110-RFLP，MIRU-VNTR和Spoligotyping。IS6110-RFLP应用广泛，分辨率较高，但该方法基于大量菌株的培养，价格高，时间长且IS6110拷贝数较少的菌株不易分型；MIRU-VNTR不需要大量培养菌株，结果容易读识，但由于位脱氧核苷酸点组合不同，其分辨率和成簇率亦不尽相同；Spoligotyping分型方法用时较短，成本较低，但分辨率较低，图片结果易产生假阳性。因此一种改进的鉴别结核分枝杆菌菌种的方法是目前需要的。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记，该SNP分子标记在结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌中具有多态性。本专利技术的第二目的在于提供一种用于鉴别分枝杆菌的引物组合物，该引物组合物能够扩增分布有所述SNP标记的基因。本专利技术的第三目的在于提供一种用于鉴别鉴别分枝杆菌的方法，该方法能够鉴别出的分枝杆菌包括结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌。本专利技术的第四目的在于提供一种上述用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记、上述用于鉴别分枝杆菌的引物组合物、上述试剂盒或上述鉴别分枝杆菌的方法在制备用于检测结核病试剂盒中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：一种用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记，包括：位于Hsp65基因的SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9、SNP10、SNP11和SNP12，所述Hsp65基因具有如SEQIDNO.1所示序列；位于rrs基因的SNP13、SNP14、SNP15和SNP16，所述rrs基因具有如SEQIDNO.2所示序列；和，位于pncA基因的SNP17，所述pncA基因具有如SEQIDNO.3所示序列；所述SNP1自SEQIDNO.1所示序列5’端起130位的碱基是C、T或A；所述SNP2自SEQIDNO.1所示序列5’端起154位的碱基是C、G或T；所述SNP3自SEQIDNO.1所示序列5’端起157位的碱基是T或C；所述SNP4自SEQIDNO.1所示序列5’端起181位的碱基是G、T或C；所述SNP5自SEQIDNO.1所示序列5’端起182位的碱基是C或T；所述SNP6自SEQIDNO.1所示序列5’端起184位的碱基是G、C或T；所述SNP7自SEQIDNO.1所示序列5’端起187位的碱基是C、A、G或T；所述SNP8自SEQIDNO.1所示序列5’端起193位的碱基是G、C或A；所述SNP9自SEQIDNO.1所示序列5’端起241位的碱基是C或G；所述SNP10自SEQIDNO.1所示序列5’端起299位的碱基是G、A或T；所述SNP11自SEQIDNO.1所示序列5’端起346位的碱基是G、T或C；所述SNP12自SEQIDNO.1所示序列5’端起442位的碱基是C或G；所述SNP13自SEQIDNO.2所示序列5’端起87位的碱基是T或C；所述SNP14自SEQIDNO.2所示序列5’端起179位的碱基是A或T；所述SNP15自SEQIDNO.2所示序列5’端起220位的碱基是G或A；所述SNP16自SEQIDNO.2所示序列5’端起224位的碱基是G、T或A；所述SNP17自SEQIDNO.3所示序列5’端起269位的碱基是C或G；所述分枝杆菌包括：结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌。本专利技术还提供了一种用于鉴别分枝杆菌的引物组合物，包括引物对Myco1、引物对Myco2和引物对Myco3；引物对Myco1包括具有如SEQIDNO.4所示序列的引物和具有如SEQIDNO.5所示序列的引物；引物对Myco2包括具有如SEQIDNO.6所示序列的引物和具有如SEQIDNO.7所示序列的引物；引物对Myco3包括具有如SEQIDNO.8所示序列的引物和具有如SEQIDNO.9所示序列的引物。优选地，所述引物组合物中的引物经过修饰；所述修饰包括磷酸化修饰、生物素修饰、地高辛修饰、硫代修饰、反向dT修饰或荧光修饰。本专利技术还提供了一种包含上述引物组合物的试剂盒。本专利技术还提供了一种鉴别分枝杆菌的方法，该方法包括检测待测样品的所述SNP分子标记的多态性，比较待测样品的分子标记与野生型的区别，以判定待测样品的菌种；所述野生型的Hsp65基因具有如SEQIDNO.1所示序列；rrs基因具有如SEQIDNO.2所示序列；pncA基因具有如SEQIDNO.3所示序列；其中，若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为T、SNP2为G、SNP4为T、SNP6为T、SNP8为C、SNP10为A和SNP11为T，则鉴别为脓肿分枝杆菌；若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为A和SNP12为G，则鉴别为非洲分枝杆菌；若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP6为C、SNP9为G、SNP10为T和SNP11为C，则鉴别为鸟分枝杆菌；若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP1为A和SNP17为G，则鉴别为牛型分枝杆菌；若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP2为G、SNP3为C、SNP4为T、SNP7为A、SNP8为C、SNP10为A和SNP11为T，则鉴别为偶发分枝杆菌；若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP3为C、SNP6为C、SNP7为G、SNP9为G和SNP11为C，则鉴别为胃分枝杆菌；若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP7为G、SNP9为G和SNP10为T，则鉴别为胞内分枝杆菌；若待测样品与所述野生型的区别在于：SNP2为T、SNP3为C、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记，包括：位于Hsp65基因的SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9、SNP10、SNP11和SNP12，所述Hsp65基因具有如SEQ ID NO.1所示序列；位于rrs基因的SNP13、SNP14、SNP15和SNP16，所述rrs基因具有如SEQ ID NO.2所示序列；和，位于pncA基因的SNP17，所述pncA基因具有如SEQ ID NO.3所示序列；所述SNP1自SEQ ID NO.1所示序列5’端起130位的碱基是C、T或A；所述SNP2自SEQ ID NO.1所示序列5’端起154位的碱基是C、G或T；所述SNP3自SEQ ID NO.1所示序列5’端起157位的碱基是T或C；所述SNP4自SEQ ID NO.1所示序列5’端起181位的碱基是G、T或C；所述SNP5自SEQ ID NO.1所示序列5’端起182位的碱基是C或T；所述SNP6自SEQ ID NO.1所示序列5’端起184位的碱基是G、C或T；所述SNP7自SEQ ID NO.1所示序列5’端起187位的碱基是C、A、G或T；所述SNP8自SEQ ID NO.1所示序列5’端起193位的碱基是G、C或A；所述SNP9自SEQ ID NO.1所示序列5’端起241位的碱基是C或G；所述SNP10自SEQ ID NO.1所示序列5’端起299位的碱基是G、A或T；所述SNP11自SEQ ID NO.1所示序列5’端起346位的碱基是G、T或C；所述SNP12自SEQ ID NO.1所示序列5’端起442位的碱基是C或G；所述SNP13自SEQ ID NO.2所示序列5’端起87位的碱基是T或C；所述SNP14自SEQ ID NO.2所示序列5’端起179位的碱基是A或T；所述SNP15自SEQ ID NO.2所示序列5’端起220位的碱基是G或A；所述SNP16自SEQ ID NO.2所示序列5’端起224位的碱基是G、T或A；所述SNP17自SEQ ID NO.3所示序列5’端起269位的碱基是C或G；所述分枝杆菌包括：结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌。...

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别分枝杆菌的SNP分子标记，包括：位于Hsp65基因的SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9、SNP10、SNP11和SNP12，所述Hsp65基因具有如SEQIDNO.1所示序列；位于rrs基因的SNP13、SNP14、SNP15和SNP16，所述rrs基因具有如SEQIDNO.2所示序列；和，位于pncA基因的SNP17，所述pncA基因具有如SEQIDNO.3所示序列；所述SNP1自SEQIDNO.1所示序列5’端起130位的碱基是C、T或A；所述SNP2自SEQIDNO.1所示序列5’端起154位的碱基是C、G或T；所述SNP3自SEQIDNO.1所示序列5’端起157位的碱基是T或C；所述SNP4自SEQIDNO.1所示序列5’端起181位的碱基是G、T或C；所述SNP5自SEQIDNO.1所示序列5’端起182位的碱基是C或T；所述SNP6自SEQIDNO.1所示序列5’端起184位的碱基是G、C或T；所述SNP7自SEQIDNO.1所示序列5’端起187位的碱基是C、A、G或T；所述SNP8自SEQIDNO.1所示序列5’端起193位的碱基是G、C或A；所述SNP9自SEQIDNO.1所示序列5’端起241位的碱基是C或G；所述SNP10自SEQIDNO.1所示序列5’端起299位的碱基是G、A或T；所述SNP11自SEQIDNO.1所示序列5’端起346位的碱基是G、T或C；所述SNP12自SEQIDNO.1所示序列5’端起442位的碱基是C或G；所述SNP13自SEQIDNO.2所示序列5’端起87位的碱基是T或C；所述SNP14自SEQIDNO.2所示序列5’端起179位的碱基是A或T；所述SNP15自SEQIDNO.2所示序列5’端起220位的碱基是G或A；所述SNP16自SEQIDNO.2所示序列5’端起224位的碱基是G、T或A；所述SNP17自SEQIDNO.3所示序列5’端起269位的碱基是C或G；所述分枝杆菌包括：结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌和猿分枝杆菌。2.用于鉴别分枝杆菌的引物组合物，其特征在于，包括引物对Myco1、引物对Myco2和引物对Myco3；引物对Myco1包括具有如SEQIDNO.4所示序列的引物和具有如SEQIDNO.5所示序列的引物；引物对Myco2包括具有如SEQIDNO.6所示序列的引物和具有如SEQIDNO.7所示序列的引物；引物对Myco3包括具有如SEQIDNO.8所示序列的引物和具有如SEQIDNO.9所示序列的引物。3.根据权利要求2所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物中的引物经过修饰；所述修饰包括磷酸化修饰、生物素修饰、地高辛修饰、硫代修饰、反向dT修饰或荧光修饰。4.包含上述权利要求2或3项所述的引物组合物的试剂盒。5.一种鉴别分枝杆菌的方法，其特征在于，包括检测待测样品的所述SNP分子标记的多态性，比较待测样品的分子标记与野生型的区别，以判定待测样品的菌种；所述野生型的Hsp65基因具有如SEQIDNO.1所示序列；rrs基因具有如SEQIDNO.2所示序列；pncA基因具有如SEQIDNO.3所示序列；其中，若待测样品与所述野...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙照刚，段慧娟，孔成成，曹廷明，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京胸科医院，
类型：发明
国别省市：北京,11