一种快速的基于Ct值的从多种近似种中鉴别褐飞虱的引物、试剂盒及方法技术

一种用于鉴定褐飞虱的特异性引物对、质控重组质粒、试剂盒及其检测方法，属于害虫预测预报技术领域。本发明专利技术公开了一种用于鉴别褐飞虱的引物对Nl‑Its1‑F1/Nl‑Its1‑R1；还公开了用于鉴定褐飞虱的试剂盒及其检测方法，试剂盒包括2×Reaction Buffer Mix，上述引物对和一个质控重组质粒P；该方法是以粗组织液为定量扩增模板，通过比较样本与质控质粒Ct值的大小，即可判断是否为褐飞虱。上述一种用于鉴定褐飞虱的特异性引物对、质控重组质粒、试剂盒及其检测方法，可直接用于基层植保站对褐飞虱的快速鉴定，对节省人力物力和提高水稻重大害虫褐飞虱的预测预报准确度具有极为重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种快速的基于Ct值的从多种近似种中鉴别褐飞虱的引物、试剂盒及方法
本专利技术属于害虫预测预报
，具体为一种快速的基于Ct值的从多种近似种中鉴别褐飞虱的引物、试剂盒及方法。
技术介绍
水稻（OryzasativaL.）是中国乃至全球最重要的粮食作物之一，其产量和品质直接关系到世界人民的温饱问题和幸福满意度。在中国，水稻的产量则直接关系到我国的粮食安全。但水稻受病虫草为害严重，虽经防治仍然造成可观的经济损失。褐飞虱[Nilaparvatalugens(Stål)]是亚洲稻区最严重的水稻害虫之一，具远距离迁飞习性。准确的虫情预测预报是害虫防治的关键，目前主要采用灯诱监测。测报灯下褐飞虱的始见日、迁入量、迁入峰是褐飞虱预测预报的重要依据，也是褐飞虱防治策略制定的关键信息依据。拟褐飞虱[Nilaparvatabakeri(Muir)]和伪褐飞虱[NilaparvatamuiriChina]是褐飞虱的同属近似种，并不以水稻为适宜寄主。但它们与褐飞虱具有广泛的共同分布区域，发生季节也有交叉，且都具有趋光性，对预测预报的准确性造成了严重影响。褐飞虱、拟褐飞虱和伪褐飞虱形态非常相似，肉眼难以区分。传统的形态学鉴定方法，耗时费力，需专业人员借助于显微镜才能区分。然而，即使是专业人员，有时对有损标本和若虫也无能为力。崔亚丽等（2012年）以纯DNA为模板，初步建立了褐飞虱、拟褐飞虱和伪褐飞虱的多重PCR检测技术，但具有耗时长，费用高等缺点；刘淑华等（2018年）以粗组织液为模板，建立了三种飞虱的直接多重PCR检测技术，但需要凝胶电泳检测环节，也具有耗时长、人为出错率高的不足。因此，植保人员急需一种简便，快速，易操作的鉴定方法。荧光定量PCR(real-timePCR，RT-PCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程。Ct值(Cyclethreshold，循环阈值)是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。Ct值与初始模板量存在一定负相关性，可用于初始模板量的计算。目前，荧光定量技术已被广泛用于医学与检疫领域的物种鉴定，但对于褐飞虱及其近似种的鉴别，还没有相关人员尝试。另外，目前结合荧光定量PCR技术进行微生物和检疫物种鉴定的方法或是以纯DNA为模板，或是以探针法进行的，亦具有耗时长，耗费高的缺点。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术的目的在于设计提供一种快速的基于Ct值的从多种近似种中鉴别褐飞虱的引物、试剂盒及方法的技术方案，该方法通过比较样本与质控质粒Ct值的大小，即可判断是否为褐飞虱。本专利技术不需DNA提取，用水研磨的粗组织液即可作为模板；本专利技术由于包含了质控质粒，是用定量的思路方法进行定性，对试剂及耗材的质量要求不高；本专利技术只需两个温度，30循环即可，1小时内便可得到结果。该特异性引物和试剂盒及建立的检测方法具有灵敏、快速、高通量和简单易操作等优点，可直接用于基层植保站对褐飞虱的快速鉴定，对节省人力物力和提高水稻重大害虫褐飞虱的预测预报准确度具有极为重要的意义。所述的一种用于鉴定褐飞虱的特异性引物对，其特征在于包括上游引物Nl-Its1-F1和下游引物Nl-Its1-R1，上游引物Nl-Its1-F1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，下游引物Nl-Its1-R1的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。所述的一种用于鉴定褐飞虱的质控重组质粒，其特征在于其DNA序列如SEQIDNo.3所示。所述的一种用于鉴定褐飞虱的试剂盒，其特征在于包括：1）特异性引物对，上游引物Nl-Its1-F1和下游引物Nl-Its1-R1，上游引物Nl-Its1-F1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，下游引物Nl-Its1-R1的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；2）质控重组质粒，其DNA序列如SEQIDNo.3所示；3）PCR反应液，所述的PCR反应液包含2×ReactionBufferMix，ddH2O。所述的一种用于鉴定褐飞虱的试剂盒，其特征在于反应体系包括2×ReactionBufferMix，ddH2O，上游引物Nl-Its1-F1和下游引物Nl-Its1-R1，浓度为20×10-6ng/μL的质控重组质粒。所述的一种用于鉴定褐飞虱的试剂盒，其特征在于质控重组质粒的使用浓度为4×10-6ng/μL。所述的一种用于鉴定褐飞虱的试剂盒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）取待测飞虱单头个体，用蒸馏水制备样本粗组织液；2）制备含上述2条特异引物的荧光定量PCR扩增体系，以质控重组质粒P作为临界模板；3）将上述PCR反应液上机进行扩增；4）结果分析。所述的一种用于鉴定褐飞虱的试剂盒的检测方法，其特征在于步骤1）中样本粗组织液的具体制备方法为：取单头待测样本放入1.5ml离心管中，再加入500μLddH2O研磨，手动研磨或自动研磨机研磨，自动研磨机的参数为5HZ，90s。所述的一种用于鉴定褐飞虱的试剂盒的检测方法，其特征在于步骤2）扩增体系中，各组分的具体比例为：2×ReactionBufferMix5μL，ddH2O2.8μL，浓度为10pmol/μL的上游引物Nl-Its1-F1和下游引物Nl-Its1-R1各0.1μL，浓度为20×10-6ng/L的质控重组质粒2μL或样本粗组织液2μL，用ddH2O补足10μL。所述的一种用于鉴定褐飞虱的试剂盒的检测方法，其特征在于步骤3）扩增条件中：具体为95℃、50s，60℃、25s，共30个循环。所述的一种用于鉴定褐飞虱的试剂盒的检测方法，其特征在于步骤4）结果分析中：根据Ct值的大小判断，当样本的CtS小于质控质粒P的CtP值时，则为褐飞虱，反之则不是褐飞虱。本专利技术根据褐飞虱、拟褐飞虱和伪褐飞虱这几个近似种的ITS1（internaltranscribedspacer1,核糖体内转录间隔区1）的序列设计特异性引物。昆虫ITS具有进化速率快，物种间差异较大而物种内比较保守，拷贝数多的特点，被广泛应用于物种鉴别。本专利技术所采取的技术方案是筛选了褐飞虱ITS基因的特异性引物、构建了质控重组质粒，建立了该虫的快速分子鉴定方法。上述一种快速的基于Ct值的从多种近似种中鉴别褐飞虱的引物、试剂盒及方法，具有以下有益效果：1.根据褐飞虱及其近似种拟褐飞虱、伪褐飞虱的ITS1序列，筛选了褐飞虱特异性引物，建立了基于荧光定量PCR技术的从近似种中鉴别目标害虫褐飞虱的快速检测方法，克服了传统形态学检测的局限，实现了对褐飞虱的快速、准确检测。2.本方法中是以粗组织液作为定量模板，此法为国内首创，为相关快速检测技术的创新开拓了思路；本方法是以定量的方法和思维进行定性，因此不需对结果进行复杂分析，只需比较Ct值的大小就可以判别是否为目标物种，因此对试剂和耗材的质量要求不高，成本较普通定量低；本方法只需2个不同温度的循环，为后期可便携式褐飞虱检测装置的研制奠定了基础；本方法只需10μL反应体系，大大节省了经济成本。3.综上所述，本专利技术的褐飞虱快速检测和鉴定方法具有准确、操作简便、高通量、快速，对操作人员要求不高等优点，较传统的形态学鉴定方法具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种用于鉴定褐飞虱的特异性引物对，其特征在于包括上游引物Nl‑Its1‑F1和下游引物Nl‑Its1‑R1，上游引物Nl‑Its1‑F1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物Nl‑Its1‑R1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定褐飞虱的特异性引物对，其特征在于包括上游引物Nl-Its1-F1和下游引物Nl-Its1-R1，上游引物Nl-Its1-F1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，下游引物Nl-Its1-R1的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。2.一种用于鉴定褐飞虱的质控重组质粒，其特征在于其DNA序列如SEQIDNo.3所示。3.一种用于鉴定褐飞虱的试剂盒，其特征在于包括：1）特异性引物对，上游引物Nl-Its1-F1和下游引物Nl-Its1-R1，上游引物Nl-Its1-F1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，下游引物Nl-Its1-R1的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；2）质控重组质粒，其DNA序列如SEQIDNo.3所示；3）PCR反应液，所述的PCR反应液包含2×ReactionBufferMix、ddH2O。4.如权利要求3所述的一种用于鉴定褐飞虱的试剂盒，其特征在于反应体系包括2×ReactionBufferMix5μL，ddH2O2.8μL，浓度为10pmol/μL的上游引物Nl-Its1-F1和下游引物Nl-Its1-R1各0.1μL，浓度为20×10-6ng/μL的质控重组质粒2μL或样本粗组织液2μL。5.如权利要求3所述的一种用于鉴定褐飞虱的试剂盒，其特征在于质控重组质粒的使用浓度为4×10-6ng/μL。6.采用权利要求3所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘淑华，唐健，周明好，杨保军，王爱英，罗举，
申请(专利权)人：中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33