中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测方法及应用。该方法以中国黄牛全基因组DNA为模板，用引物对P1‑P4通过PCR扩增中国黄牛PPP2R2B基因部分片段；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点的基因型；该基因的重复缺失多态性不同基因型分别与四种中国黄牛，包括秦川牛、南阳牛、郏县牛与鲁西牛的体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等生长性状之间显著相关。该方法可在肉牛生长性状的标记辅助选择育种中应用，有利于快速建立遗传资源优良的中国黄牛种群，从而加快具有优良生长性状的中国黄牛的良种选育速度。

【技术实现步骤摘要】
中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测方法及应用
本专利技术属于生物技术与家畜育种领域，涉及基因插入缺失(indel)的检测方法，特别涉及一种黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测方法，该方法能够快速、准确检测中国黄牛PPP2R2B基因AC_000164.1位点4个重复缺失多态性，并能够用于中国黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。
技术介绍
当今中国经济飞速发展，人民生活正步入全面小康，对肉蛋奶等动物源性食品需求量越来越大，对品种和质量的要求日益增高。虽然畜牧业总产值的比例已超过农业总产值的三分之一，但畜牧业总体生产水平仍相对低下。肉牛产业作为畜牧业中的重要组成部分，对于改善人们膳食结构、促进农民增收、满足人们消费需求、促进农村劳动力就业、发展农村经济及推动相关产业发展等方面有着十分重要的意义。改革开放以来，中国肉牛产业取得了较快的发展，但目前我国大量繁育的肉牛普遍存在着品种的良种率较低、生产的牛肉质量档次偏低以及犊牛的生产水平较低等缺点。据中国数据库显示，就存栏牛年头均产肉量而言，发达国家普遍达到80～90公斤，而我国仅为46.98公斤；就肉牛胴体重而言，发达国家多在331公斤/头以上，世界平均水准为205公斤/头，而我国仅为147公斤/头。另外据联合国粮农组织数据库显示，中国本土牛肉产量排在世界前列，但肉牛胴体重排名却显著下降。杂交改良、品系选育等传统育种因其效率取决于高价值个体的识别，选择强度，繁殖与育种周期和有限的遗传多样性等而传面临突变频率低、繁殖与育种周期长、遗传资源限制等诸多挑战。自分子生物学技术快速发展以来，使基于大量样本的分子标记挖掘和鉴定变得更加简便，大幅推动了分子育种技术的发展。畜牧产业发达的国家针对本国家畜品种的重要经济性状进行数量性状基因座(quantitativetraitlocus，QTL)定位和主效基因挖掘，利用基因辅助育种(gene-assistedselection，GAS)和分子标记辅助育种(marker-assistedselection，MAS)技术提高了目标性状的选育速度和准确度，培育出一批性状优良的国际知名的优良家畜品种。高通量测序技术的发展使得插入/缺失(insertion-deletion，InDel)标记开发成本降低，InDel适用于全基因组分子标记的开发。与其他分子标记相比，基因组同一位点发生相同长度大小的InDel突变的几率极小，可看作同一来源，所以InDel标记准确性高、变异稳定，避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。因此，引入标记辅助选择的分子育种手段(InDel)开发有效的生长发育分子标记，分析影响肉牛生产增长的因素，找出促进良种产业化的动因，提高目标性状的选育速度和准确度，对于加快牛肉产量增长具有重要意义。不仅可以获得肉牛最基本的生物遗传信息与自主知识产权的功能性新基因，而且能为我国地方牛品种基因资源研究和遗传改良提供理论基础。蛋白磷酸酶2调节亚基Bβ(Proteinphosphatase2regulatorysubunitBbeta，PPP2R2B)位于牛第7号染色体，有9个外显子，属于磷酸酶2调节亚基B家族，此基因的表达产物蛋白磷酸酶2(Proteinphosphatase2，PP2A)是四种主要的Ser/Thr磷酸酶之一。PPP2R2B与多种基因互作，其中PP2A通过去磷酸化来负调控PI3(磷脂酰肌醇)激酶/Akt信号通路，而PI3Ks信号参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。此外，其dSTRIPAKPP2A复合物在发育过程中通过去磷酸化阻止Hippo通路激活导致细胞凋亡增加，组织生长减少，是Hpo信号的主要调控因子，与细胞生长和分裂的负调控有关，在调节代谢等方面有着重要作用。因此，PPP2R2B基因碱基序列的插入缺失可能影响牛的生长性状。总的来说，基于全基因组分析和之前的研究，通过分析PPP2R2B基因多态性中对黄牛生长性状的促进作用，可为肉牛高效选育提供依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测方法及应用，即利用PCR扩增方法检测中国黄牛PPP2R2B基因的插入/缺失多态性，从而加快良种选育速度。为了实现上述任务，本专利技术采用如下的技术解决方案：一种中国黄牛PPP2R2B基因重复缺失多态性的检测方法，其特征在于，该方法以中国黄牛全基因组DNA为模板，用引物对P1、P2、P3和P4通过PCR扩增中国黄牛PPP2R2B基因部分片段(具体位于基因的内含子区)；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点的基因型；其中：引物对P1为：上游引物：5'-GCATCAGCCCTAAATCCCA-3'；下游引物：5'-CAGAAAATATCAAAATGCCAGAA-3'。引物对P2为：上游引物：5'-AGTCTTAGTTTAGAGGGCTTCC-3'；下游引物：5'-GCTTAGTCATTCAGCCATTTT-3'。引物对P3为：上游引物：5'-GCTGATCCCTCAAATATGGC-3'；下游引物：5'-TGAAAGCGTCAAGAGCAAG-3'。引物对P4为：上游引物：5'-CAACTGGAAAAGCTAAGGC-3'；下游引物：5'-TGGAATCAGATGGAAGAAAG-3'。根据本专利技术，所述中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点是指：中国黄牛PPP2R2B基因位点1(L1)AC_000164.1：g.60192910_60192929delGCTTGCTATATGTGATTCTG；中国黄牛PPP2R2B基因位点2(L2)AC_000164.1：g.60117040_60117065delGCCTGAAAAATCCCATGGACAGAGAA；中国黄牛PPP2R2B基因位点3(L3)AC_000164.1：g.60254430_60254454delTCCCCAATCCAGCAATGCTGGATGT；和中国黄牛PPP2R2B基因位点4(L4)AC_000164.1：g.60149610_60149643delCATCTTTTCAAAATTTCTATAGCATTCTATAGCA；上述四个中国黄牛PPP2R2B基因位点上存在的不同的重复缺失多态性片段。进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：95.0℃预变性5min；95.0℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，2个循环；之后每2个循环降退火温2-3℃；94.0℃变性30s，53℃退火30s，72.0℃延伸20s，30个循环；最后72.0℃延伸10min，所得的扩增产物4℃条件下保存。所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为2.0-3.0％的琼脂糖凝胶。所述电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失(Indel)多态性4个位点的基因型分别为：电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上位点1(L1)的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：插入/插入(II)基因型，表现为197bp一条带纹；插入/缺失(ID)基因型，表现为197bp和177bp两条带纹；缺失/缺失(DD)基因型，表现为177b本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测方法，其特征在于，该方法以中国黄牛全基因组DNA为模板，用引物对P1、P2、P3和P4通过PCR扩增中国黄牛PPP2R2B基因部分片段；再对PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点的基因型；其中：引物对P1为：上游引物：5'‑GCATCAGCCCTAAATCCCA‑3'；下游引物：5'‑CAGAAAATATCAAAATGCCAGAA‑3'。引物对P2为：上游引物：5'‑AGTCTTAGTTTAGAGGGCTTCC‑3'；下游引物：5'‑GCTTAGTCATTCAGCCATTTT‑3'。引物对P3为：上游引物：5'‑GCTGATCCCTCAAATATGGC‑3'；下游引物：5'‑TGAAAGCGTCAAGAGCAAG‑3'；引物对P4为：上游引物：5'‑CAACTGGAAAAGCTAAGGC‑3'；下游引物：5'‑TGGAATCAGATGGAAGAAAG‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测方法，其特征在于，该方法以中国黄牛全基因组DNA为模板，用引物对P1、P2、P3和P4通过PCR扩增中国黄牛PPP2R2B基因部分片段；再对PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点的基因型；其中：引物对P1为：上游引物：5'-GCATCAGCCCTAAATCCCA-3'；下游引物：5'-CAGAAAATATCAAAATGCCAGAA-3'。引物对P2为：上游引物：5'-AGTCTTAGTTTAGAGGGCTTCC-3'；下游引物：5'-GCTTAGTCATTCAGCCATTTT-3'。引物对P3为：上游引物：5'-GCTGATCCCTCAAATATGGC-3'；下游引物：5'-TGAAAGCGTCAAGAGCAAG-3'；引物对P4为：上游引物：5'-CAACTGGAAAAGCTAAGGC-3'；下游引物：5'-TGGAATCAGATGGAAGAAAG-3'。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点是指：中国黄牛PPP2R2B基因位点1(L1)AC_000164.1：g.60192910_60192929delGCTTGCTATATGTGATTCTG；中国黄牛PPP2R2B基因位点2(L2)AC_000164.1：g.60117040_60117065delGCCTGAAAAATCCCATGGACAGAGAA；中国黄牛PPP2R2B基因位点3(L3)AC_000164.1：g.60254430_60254454delTCCCCAATCCAGCAATGCTGGATGT；和中国黄牛PPP2R2B基因位点4(L4)AC_000164.1：g.60149610_60149643delCATCTTTTCAAAATTTCTATAGCATTCTATAGCA；上述四个中国黄牛PPP2R2B基因位点上存在的不同的重复缺失多态性片段。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95.0℃预变性5min；95.0℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，2个循环；之后每2个循环降退火温2℃-3℃；94.0℃变性30s，53℃退火30s，72.0℃延伸20s，30个循环；最后72.0℃延伸10min，所得的扩增产物4℃条件下保存。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为2.0-3.0％的琼脂糖凝胶。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中国黄牛选自秦川牛，南阳牛，鲁西牛或郏县牛。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因位点1(L1)的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：插入/插入(II)基因型，表现为197bp一条带纹；插入/缺失(ID)基因型，表现为197bp和177bp两条带纹；缺失/缺失(DD)基因型，表现为177bp一条带纹；其中：缺失/缺失(DD)基因型作为秦川牛生长性状的分子标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑辉，孙秀柱，李泽，樊路杰，王国艳，江钧益，刘世荣，易晓华，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61