鉴别日本医蛭的特异性引物对和方法、应用技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定日本医蛭的特异性引物对，由引物RY‑5’和引物RY‑3’组成，所述引物RY‑5’和所述引物RY‑3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1和序列2。采用该特异性引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品中含有或候选含有日本医蛭；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品中不含有或候选不含有日本医蛭。本发明专利技术能有效得将日本医蛭与其他水蛭样品进行区分，快速、简便。

【技术实现步骤摘要】
鉴别日本医蛭的特异性引物对和方法、应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及鉴别日本医蛭的特异性引物对和方法、应用。
技术介绍
水蛭(HIRUDO)别名马蛭、麻黄蜞、马蟥，属环节动物门蛭纲医蛭形亚目医蛭科。《神农本草经》记载：“水蛭主逐恶血、瘀血，月闭、破血瘕积聚……”。水蛭作为中药，迄今已有3000多年的历史。现代中医学认为水蛭属活血化瘀药下属分类的活血调经药，可以抑制血小板的释放、降低血脂、抑制成纤维细胞增殖；用于防治血栓疾病、控制癌症细胞转移与增值等。水蛭的功效与其抗凝血作用密切相关，其中最重要的、疗效最好的抗凝血活性物质是水蛭素(Hirudin)，它是迄今为止世界上最有效和最安全的天然凝血酶抑制剂，与胰岛素、青蒿素被称为拯救人类疾病的“世界三素”，具有极高的药用价值。2015版《药典》规定用于药用的水蛭为水蛭科动物蚂蟥WhitmaniapigraWhitman(即宽体金线蛭)、水蛭Hirudonippponicawhitman(即日本医蛭)或柳叶蚂蟥WhitmaniaacranulataWhitman(即尖细金线蛭)。值得注意的是，世界上的水蛭有500多种，我国有97种，它们分属于不同的目、科和属，在形态结构、取食习性、生活环境以及体内所含生物活性物质的结构和功能方面都是十分不相同的。专利技术人对我国安徽亳州、河南禹州、四川成都荷花池和湖北蕲春几个主要中药材市场销售的水蛭以及近十种水蛭中成药的原料作了调查发现，中药水蛭的资源极度紧缺；同时，水蛭的生产和贸易缺乏行业规范，来源混乱，存在着严重的相似品种水蛭品种混淆用药问题。不同品种、疗效有差异的水蛭品种混用影响水蛭中药材质量，也给临床用药带来极大的安全隐患。为了临床用药安全、准确和有效，针对外形相近的不同中药材品种建立一种有效准确的鉴定方法成为已经成为迫在眉睫的需求。水蛭的传统鉴定方法是通过性状鉴别、显微鉴别等方法，这些鉴别方法容易受到鉴定人员、药材生长环境、生长年限以及产地加工等诸多影响；并且，目前尚没有一种成熟的理化鉴定方法用于水蛭品种鉴别。而随着分子生物学迅速发展，DNA水平上的多样性研究取得突破性进展，以DNA条形码技术与基于特异性引物的聚合酶链式反应方法为代表的，用于药用的动植物的分子鉴定技术也日渐完善。CN2014101625452以DNA条形码技术鉴定宽体金线蛭，通过对标准目的基因的DNA序列测定与比对分析，根据与理论序列的相似性进行判定的物种鉴定技术。但这种方法在检测过程中迟迟没有推广起来，该方法存在着判定标准不严格、实际应用性不强等限制。具体原因主要有以下三个方面：一是过程复杂，耗时费力。DNA条形码实验需要经过提取DNA、聚合酶链式反应(PCR)，PCR产物电泳验证、委托测序以及测序结果的手工校对、序列拼接、与公开序列进行比对等诸多步骤，不适用于快速、高通量的应用检测。二是，结果稳定性较差，序列测定步骤复杂，测序反应的结果收到样品前处理与反应条件的影响而质量不一，影响物种判定结论。三是，缺乏明确的判定标准，通常如果目标基因与所述理论基因序列SEQIDNO.1的同源性在99％以上，即可判断待测样品的物种。但是，根据基因不同，待测物种不同，序列在物种间的变异程度是不相同的。因此，缺乏一个稳定、准确、清晰的同源性标准进行判定。具体到日本医蛭来说，日本医蛭是药典中规定的医用水蛭品种之一。由于个体较小、饲养困难，在中药市场上极易被混淆使用。目前还没有特异性方法鉴别日本医蛭。因此，需要建立一种快速、准确、分辨率高、易于操作的日本医蛭鉴定方法以弥补鉴定领域空白与现有技术的复杂费时、准确度不高的不足。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种鉴别日本医蛭的方法和特异性引物对，有效得将日本医蛭与其他水蛭样品进行区分，快速、简便。本专利技术为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：本专利技术首先提供一种用于鉴别日本医蛭的特异性引物对，可由引物RY-5’和引物RY-3’组成，所述引物RY-5’和所述引物RY-3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1(5’CCAGCTATATCATTAAGTCAAT3’)和序列2(5’CTTAATGGAGTATTTTGAATT3’)。上述用于鉴定日本医蛭的特异性引物对中，所述引物RY-5’和所述引物RY-3’的摩尔比可为1:1。上述用于鉴定日本医蛭的特异性引物对的应用，为如下a)-f)中任一种：a)制备用于检测或辅助检测日本医蛭的试剂盒；b)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有日本医蛭；c)制备用于鉴定或辅助鉴定日本医蛭的试剂盒；d)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为日本医蛭；e)制备用于鉴定或辅助鉴定市售日本医蛭的真伪性的试剂盒；f)鉴定或辅助鉴定市售日本医蛭的真伪性。本专利技术还提供了用于鉴定日本医蛭的试剂盒。本专利技术所提供的用于鉴定日本医蛭的试剂盒含有上述用于鉴定日本医蛭的引物对。其中，它还可以包括TaqDNA聚合酶、dNTP、水或反应缓冲液等。上述用于鉴定日本医蛭的试剂盒的应用也属于本专利技术的保护范围。上述用于鉴定日本医蛭的试剂盒的应用可为如下b1)或b2)或b3)：b1)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有日本医蛭；b2)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为日本医蛭；b3)鉴定或辅助鉴定市售日本医蛭的真伪性。本专利技术还提供了一种检测待测样品是否含有或候选含有日本医蛭的方法，可包括如下步骤：提取待测样品的总DNA作为模板，采用上述用于鉴定日本医蛭的引物对(或试剂盒)进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品中含有或候选含有日本医蛭；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品中不含有或候选不含有日本医蛭。本专利技术还提供了一种鉴定待测样品是否为或候选为日本医蛭的方法，可包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，采用上述用于鉴定日本医蛭的引物对(或试剂盒)进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品为或候选为日本医蛭；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品不为或候选不为日本医蛭。本专利技术还提供了一种鉴定市售日本医蛭的真伪性的方法，可包括如下步骤：提取市售日本医蛭的基因组DNA作为模板，采用上述用于鉴定日本医蛭的引物对(或试剂盒)进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述市售日本医蛭为或候选为真品；如果不能实现有效扩增，则所述市售日本医蛭为或候选为伪品。上述任一所述方法中，所述“能够实现有效扩增”为PCR扩增产物中含有200-300bp的DNA片段；所述“不能实现有效扩增”为PCR扩增产物中不含有200-300bp的DNA片段。其中，所述200-300bp的DNA片段可为287bp的DNA片段，如序列表中序列3所示(CCAGCTATATCATTAAGTCAATTTTATATTATATTTTTAGGGGTTAATATTACTTTTTTTCCTCAACACTTTCTAGGGCTAAGAGGAATACCACGGCGATACTCAGACTATCCAGATGTGTATATAGATTGAAATGTAGTATCATCATTTGGTTCAATTCTTTCTACTATTGCTCTTTTTTTATTTGTTTATTTATTATGAGAATCATTAAGAACTCAAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于鉴定日本医蛭的特异性引物对，其特征在于由引物RY‑5’和引物RY‑3’组成，所述引物RY‑5’和所述引物RY‑3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1(5’CCAGCTATATCATTAAGTCAAT3’)和序列2(5’CTTAATGGAGTATTTTGAATT3’)。

【技术特征摘要】
1.用于鉴定日本医蛭的特异性引物对，其特征在于由引物RY-5’和引物RY-3’组成，所述引物RY-5’和所述引物RY-3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1(5’CCAGCTATATCATTAAGTCAAT3’)和序列2(5’CTTAATGGAGTATTTTGAATT3’)。2.权利要求1所述特异性引物对的应用，其特征在于为如下a)-f)中任一种：a)制备用于检测或辅助检测日本医蛭的试剂盒；b)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有日本医蛭；c)制备用于鉴定或辅助鉴定日本医蛭的试剂盒；d)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为日本医蛭；e)制备用于鉴定或辅助鉴定市售日本医蛭的真伪性的试剂盒；f)鉴定或辅助鉴定市售日本医蛭的真伪性。3.含有权利要求1所述特异性引物对的试剂盒，其特征在于所述试剂盒用于鉴定或者辅助鉴定日本医蛭。4.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括TaqDNA聚合酶、dNTP、水或反应缓冲液。5.权利要求3所述的试剂盒的应用，其特征在于为如下b1)或b2)或b3)：b1)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有日本医蛭；b2)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为日本医蛭；b3)鉴定或辅助鉴定市售日本医蛭的真伪性。6.一种检测待测样品是否含有或候选含有日本医蛭的方法，其特征在于包括如下步骤：提取待测样品的总DNA作为模板，采用权利要求1所述的特异性引物对进行PCR扩增，如果能够实现...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文静，李丽潇，黄涛宏，刘杰，郑健，
申请(专利权)人：岛津企业管理中国有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31