环状RNA hsa_circ_0012152的新用途制造技术

本发明专利技术公开了环状RNA hsa_circ_0012152作为治疗靶点在制备治疗儿童急性髓细胞白血病药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
环状RNAhsa_circ_0012152的新用途
本专利技术属于生物医药
，具体涉及环状RNAhsa_circ_0012152的新用途。
技术介绍
急性白血病是儿童最常见的恶性肿瘤，约占该时期恶性肿瘤的35％。尽管儿童急性髓细胞白血病(acutemyeloidleukemia，AML)仅占急性白血病的20％，但其病死人数却占儿童急性白血病的50％以上。随着联合化疗、优化风险分层及造血干细胞移植技术的应用，AML患儿的存活率已大为改观，但预后依然很差，复发率高达30％以上。这不仅严重危害了患儿的身心健康，同时给患者家庭带来严重的经济负担和心理负担。因此，深入研究AML发病的分子机制，探索AML新的治疗靶点及实施个体化治疗具有重要意义。而且对于难治性AML来说，靶向治疗可能是将来的唯一出路，这将会给儿童AML的治疗带来新的希望。环状RNA(circularRNA，circRNA)是一类区别于传统线性RNA的RNA家族新成员，不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴，并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。近年来，科学家们发现在细胞中存在数以万计的序列高度保守的circRNA，这些circRNA主要定位于细胞质中，在人类细胞中广泛表达。它的主要特征之一是circRNA表达丰度高，部分circRNA的表达丰度是其线性异构体的10倍之多，并且还具有明显的组织特异性、时序特异性和疾病特异性。主要特征之二是它比线性RNA更稳定，不易被核酸外切酶降解。相比mRNA的一般半衰期为10小时，胞内的circRNA半衰期长达48小时。这些特征提示circRNA很可能在生物的生命过程中发挥着重要作用，阐明其功能有可能发现新的疾病治疗靶点。近几年来circRNA研究获得了重大的突破，研究者们已经鉴定出成千上万个circRNA，它们中有一些被报道具有重要的生物学功能，可能成为疾病诊治的新分子标志物或治疗靶点。但是这仅仅只是冰山一角，特别是circRNA与白血病的相关性以及它们在白血病中的作用尚不清楚，对儿童AML的研究更是未见报道，因此，有必要对儿童AML中的circRNA的表达、功能及其调控机制进行研究。前期，我们采用circRNA芯片V1.0技术对8例儿童AML(1例M1，2例M2，2例M4，2例M5，1例M7)患者骨髓中的5396个circRNA进行了检测，5例健康儿童作为对照。我们将AML中circRNA的表达水平与正常对照组进行比较，结果显示，表达差异有统计学意义的circRNA共计506个，其中表达上调的382个，表达下调的124个。我们选取了表达差异最显著的前10个circRNA进行了再次验证，找到了一个差异最显著的circRNA——hsa_circ_0012152。hsa_circ_0012152(chr1:44877652-44878394)是由基因RNF220(1p34.1)的第2个外显子区域单独环化而来，长742bp。目前，hsa_circ_0012152在儿童AML中的生物学作用和临床意义完全未知。
技术实现思路
本专利技术旨在研究环状RNAhsa_circ_0012152的新用途，具体涉及环状RNAhsa_circ_0012152作为治疗靶点在制备治疗儿童急性髓细胞白血病药物中的应用。另外，本专利技术旨在研究一种可用于制备治疗儿童AML药物的新靶点。一种治疗儿童急性髓细胞白血病药物的靶位点，所述靶位点为环状RNAhsa_circ_0012152的环化位点。所述靶位点序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术研究表明，hsa_circ_0012152在儿童AML中异常高表达，与对照组相比，超过近14倍。更有意思的是，在经过治疗后完全缓解的儿童AML患者中，hsa_circ_0012152急速降低，几乎与正常儿童骨髓中持平。而在未缓解和复发的儿童AML中该环状RNA同样表达上调。这一结果暗示环状RNAhsa_circ_0012152很可能可作为儿童AML治疗的新靶点，有望成为一种改善AML患者治疗和生存新策略。由于环状RNA本身的特点，本专利技术采用PCR及测序法确定了hsa_circ_0012152存在的真实性和有效性。并针对hsa_circ_0012152的环化位点(靶位点：CGGAATGACAGATGTCTTA(SEQIDNO.5))，设计了专门干扰hsa_circ_0012152表达，而不影响其亲本基因RNF220的表达的小分子干扰RNA(si-0012152)。同时构建了过表达hsa_circ_0012152的质粒载体(PCD3.1-0012152)(SEQIDNO.6)。通过将si-0012152或过表达载体转染(PCD3.1-0012152)到人急性髓细胞白血病细胞系HL60、THP-1和K562等细胞中，研究了干扰或过表达hsa_circ_0012152后，细胞生长活力、分化增殖等方面的变化。结果显示，当hsa_circ_0012152表达升高时，细胞恶性增殖，分化受阻；当hsa_circ_0012152表达降低后，细胞恶性增殖明显降低，分化成熟的能力得到加强，癌细胞死亡的比例更高。因此，hsa_circ_0012152可以作为一个潜在的靶位点应用在制备治疗儿童急性髓细胞白血病的药物中。附图说明图1为sanger测序鉴定hsa_circ_0012152的环化位点；图2为QPCR检测儿童AML不同发病阶段的骨髓中hsa_circ_0012152的表达情况；图3为过表达质粒和干扰小分子转染后效果验证；图4为hsa_circ_0012152对人髓系白血病细胞THP-1分化形态的影响；图5为hsa_circ_0012152对人髓系白血病细胞THP-1表面分化相关蛋白分子的影响；图6为hsa_circ_0012152对K562细胞凋亡的影响(红色标记凋亡小体)；图7为hsa_circ_0012152对K562细胞增殖的影响；图8为干扰hsa_circ_0012152表达后对HL60细胞增殖的影响。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式。本专利技术所涉及的技术均为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、试剂以及反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。一、测序验证环状RNAhsa_circ_0012152基因的环化位点1、细胞采集和预处理收集广州市妇女儿童医疗中心分娩孕妇的2例脐带静脉血各1ml，参加者均签署知情同意书。采用淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心法收集单个核细胞。最后加入RNAisoPlus试剂(TaKaRa)，反复吹打混匀，-80℃保存待用。2、RNA提取按照TaKaRa的RNAisoPlus试剂说明书提取RNA，测RNA浓度(A260/A280＝1.8～2.1)，放-80℃备用。3、cDNA逆转录采用TaKaRa的PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)进行cDNA逆转录。(1)按照表1配方处理以去除基因组DNA。反应程序42℃，2分钟。4℃，放置备用。表1试剂使用量5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.环状RNA hsa_circ_0012152的新用途，其特征是，环状RNA hsa_circ_0012152作为治疗靶点在制备治疗儿童急性髓细胞白血病药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.环状RNAhsa_circ_0012152的新用途，其特征是，环状RNAhsa_circ_0012152作为治疗靶点在制备治疗儿童急性髓细胞白血病药物中的应用。2.一种治疗儿...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓丹，蔡蔓斯，徐令，
申请(专利权)人：广州市妇女儿童医疗中心，
类型：发明
国别省市：广东,44