本发明专利技术公开了基于夹心法高分辨熔解曲线分析的ALK融合基因检测及分型试剂盒。通过在基因特异引物5’端添加低GC含量接头，分段式扩增出夹心序列目的片段，包含高、低GC含量共有序列和可变序列的融合基因片段。高分辨熔解曲线一般分析方法可判断融合基因有无，应用荧光强度‑温度二阶导数曲线结合关键参数分析方法，实现数字化判断融合基因类型。本发明专利技术解决了目前肺癌ALK融合基因检测成本高、周期长、难分型的问题，并集中了实时定量反转录PCR和高分辨熔解曲线分析两种技术的优势，可应用于新鲜组织、石蜡包埋组织、胸水等类型标本融合基因检测。
【技术实现步骤摘要】
基于夹心法高分辨熔解曲线分析的ALK融合基因检测及分型试剂盒
本专利技术属于体外检测
，具体涉及一种肺癌常见多种类型ALK融合基因扩增，检测并分型的试剂盒。
技术介绍
肺癌是发病率、死亡率较高的恶性肿瘤，且其发病率在我国有逐年增高趋势。个体化分子靶向治疗的出现弥补了手术治疗和传统化疗的不足，这类药物敏感患者的生存质量和生存期都得到明显提高。目前肺癌分子靶向药酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶点主要针对两类基因变异，一类是EGFR等基因的点突变、缺失突变，另一类是融合基因。基因点突变、缺失突变相对容易检测，但肺癌等实体瘤中的融合基因是基因检测的难点。融合基因是指两个基因断裂后发生重排，拼接在一起，形成新的基因，可以转录翻译出含有两个基因片段部分表达产物融合在一起的融合mRNA和融合蛋白产物。ALK融合基因是肺癌中主要融合基因类型，表现为ALK基因断裂保留其酪氨酸激酶结构域部分，其融合伴侣基因可以有多种如EML4，HIP1，KIF5B等，相同融合伴侣基因断裂位点可以为1个或多个。另外基因检测所用的组织标本不可避免的混有大量间质细胞等非肿瘤细胞，这就要求检测灵敏度要足够高。检测标本最常见的是石蜡包埋组织，由于标本经过固定、包埋等处理，常有RNA的断裂，不完整等状况，这些都增加了肺癌中检测融合基因的难度。目前主要用于检测肺癌ALK融合基因的方法有：荧光原位杂交(FISH)，免疫组织化学法，基于实时荧光定量RT-PCR和数字PCR为基础的方法，二代基因测序(NGS)等。这些方法都存在相应的问题，制约了检测ALK融合基因在临床的广泛，有效应用。FISH法应用核酸探针分别与融合的基因伴侣杂交，通过荧光显微镜观察杂交的荧光信号判断肿瘤细胞内融合基因的有无。该方法准确率高，可以形态学定位。但是检测程序操作复杂，对标本质量要求高，检测成本高，检测周期长，结果判读需要受过专业训练的病理医生判断，有一定主观性影响，假阴性率高。无法对融合基因类型分型。免疫组织化学法检测结果受标本处理过程影响较大，结果判读受主观因素干扰。虽然经国内外专家共识认可的抗体和免疫组织化学检测系统的使用极大改进了染色标准化和结果判读，假阳性率下降，但仍存在检测成本高，无法对检测到的融合基因进一步分型等问题。基于荧光定量反转录PCR法是公认的检测速度快、准确率高、灵敏度、特异性高的融合基因检测方法。现有应用及报道的这类方法核心都是应用荧光标记探针检测目标扩增的融合基因片段。但因需合成荧光标记探针，检测成本高，也没有实现多种融合基因类型的准确分型。基于二代测序(NGS)的ALK融合基因检测法可以检测已知和未知的融合基因类型及具体序列信息。但检测周期长，成本高，仪器价格昂贵，结果分析需要专门从业人员分析处理。尚难以广泛应用于临床。综上，现有肺癌ALK融合基因检测常用方法的突出问题是检测成本高，不能实现融合基因的分型。而近年研究表明，ALK融合基因融合类型不同(包括融合伴侣基因的不同和相同融合伴侣基因断裂位点的不同)的非小细胞肺癌患者对TKI药物治疗疗效、耐药产生情况和预后都有所不同。因此，检测ALK融合基因是否存在，并准确分析融合类型对指导非小细胞肺癌的TKI类药物合理选择并判断预后有重要意义。高分辨熔解曲线分析(HRMA)技术是利用DNA双链随温度升高变性解链的特性，以饱和DNA双链荧光染料为指示剂，通过记录DNA双链解链过程中荧光信号强度变化来标记DNA双链特征。这种方法广泛用于基因分型(genotype)和基因突变扫描(mutationscanning)。该方法特点是低成本(商品化饱和荧光染料稳定，价钱低，猝灭速度慢明显优于荧光标记探针)、快速、敏感、闭管操作避免二次污染，主要用于点突变和缺失突变检测，北美和欧洲应用较多。融合基因序列变化多，石蜡包埋组织常有RNA降解，间质细胞成分混杂等，同时扩增到多种融合基因类型极为困难。另外，高分辨熔解曲线技术的基因分型主要应用于纯合子、杂合子等基因类型的区分，核酸序列不同的长片段区分目前主要依靠测序，应用HRMA进行融合基因检测并分型国内外均未见报道。
技术实现思路
鉴于上述现有技术中检测ALK融合基因以及其分型中存在的问题，本专利技术提供一种检测肺癌ALK融合基因及其分型的PCR引物组合物以及利用该引物组合物检测ALK融合基因及创建荧光强度-温度二阶导数曲线的高分辨熔解曲线分析方法，并将其用于序列差异的融合基因类型区分。根据本专利技术，在一个反应管内可以同时检测至少20种ALK融合基因，并区分各融合基因类型，集中了实时定量PCR技术高敏感度、特异性、准确性特点和高分辨熔解曲线分析技术低成本、快速简便的特点，融合基因扩增和检测在一管内完成，无需开管，避免二次污染。本专利技术的技术方案如下：本专利技术的第一方面，提供一种检测肺癌ALK融合基因分型的PCR引物组合物，包括ALK基因特异性接头引物、ALK融合伴侣基因特异性接头引物、接头引物以及内参基因特异性接头引物，所述ALK基因特异性接头引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，ALK融合伴侣基因特异性接头引物的核苷酸序列为SEQIDNO:2～SEQIDNO:16中的一种或多种，所述接头引物的核苷酸序列如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示，所述内参基因特异性接头引物的核苷酸序列如SEQIDNO:19和SEQIDNO:20所示。本专利技术的第二方面，提供一种检测肺癌ALK融合基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的PCR引物组合物。所述试剂盒还包括PCR反应试剂，以及饱和双链DNA染料。本专利技术的第三方面，提供一种上述的引物组合物在制备非小细胞肺癌诊断试剂中的应用。本专利技术的第四方面，提供上述试剂盒的使用方法，即提供一种上述试剂盒按照如下方法用以检测肺癌ALK融合基因的方法，包括如下步骤：(1)提取待测样本中的总RNA，通过反转录合成cDNA；(2)以步骤(1)的合成cDNA为模板，以所述ALK基因特异性接头引物、ALK融合伴侣基因特异性接头引物、接头引物和内参基因特异性接头引物作为组合引物，进行PCR扩增反应；(3)将步骤(2)获得的PCR反应产物用于高分辨熔解曲线分析，根据样品的高分辨熔解曲线峰形判定ALK融合基因有无。还有，在上述技术方案中，在步骤(1)中所述的待测样本为石蜡包埋组织、新鲜手术切除、穿刺组织或胸水。还有，在上述技术方案中，在步骤(2)中，所述的PCR扩增反应的反应体系中，所述的ALK基因特异性接头引物、ALK融合伴侣基因特异性接头引物、接头引物和内参基因特异性接头引物的摩尔浓度比为1～3：1～3：8～20：1，优选为2：2：10：1。在上述技术方案中，所述的步骤(3)中，若判定为融合基因阳性，则应用夹心法荧光强度-温度二阶导数曲线及关键参数判断融合基因类型。所述的应用夹心法荧光强度-温度二阶导数曲线及关键参数判断融合基因类型的步骤包括如下步骤：a)对于权利要求8的步骤(3)中获得的样品的高分辨熔解曲线，通过背景去除和标准化后的高分辨熔解曲线求导获得熔解曲线导数图，对于该导数图进行二次求导，获得二阶导数曲线；b)在熔解曲线导数图的低温内参产物熔解曲线峰和高温熔解曲线峰区间内判断二阶导数曲线是否单调递增；c)当在步骤b)中判定为二阶导数曲线是单调递本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测肺癌ALK融合基因分型的PCR引物组合物，其特征在于，包括ALK基因特异性接头引物、ALK融合伴侣基因特异性接头引物、接头引物以及内参基因扩增特异性接头引物，所述ALK基因特异性接头引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，ALK融合伴侣基因特异性接头引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:16中的一种或多种，所述接头引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示，所述内参基因特异性接头引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示。
【技术特征摘要】
2019.01.08 CN 20191001710461.一种检测肺癌ALK融合基因分型的PCR引物组合物，其特征在于，包括ALK基因特异性接头引物、ALK融合伴侣基因特异性接头引物、接头引物以及内参基因扩增特异性接头引物，所述ALK基因特异性接头引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，ALK融合伴侣基因特异性接头引物的核苷酸序列为SEQIDNO:2～SEQIDNO:16中的一种或多种，所述接头引物的核苷酸序列如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示，所述内参基因特异性接头引物的核苷酸序列如SEQIDNO:19和SEQIDNO:20所示。2.一种检测肺癌ALK融合基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的PCR引物组合物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应试剂和双链DNA染料。4.权利要求1所述的引物组合物在制备非小细胞肺癌诊断试剂中的应用。5.根据权利要求2～3的任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒按照如下方法用以检测肺癌ALK融合基因：(1)提取待测样本中的总RNA，通过反转录合成cDNA；(2)以步骤(1)的合成cDNA为模板，以所述ALK基因特异性接头引物、ALK融合伴侣基因特异性接头引物、接头引物和内参基因特异性接头引物作为组合引物，进行PCR扩增反应；(3)将步骤(2)获得的PCR反应产物用于高分辨熔解曲线分析，根据样品的高分辨熔解曲线峰形判定ALK融合基因有无。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，在步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：李梅，吕申，
申请(专利权)人：大连医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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