RNA水平检测PD-1和PD-L1表达量的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种RNA水平检测PD‑1和PD‑L1表达量的试剂盒及方法。其中，该试剂盒包括：看家基因扩增引物、PD‑1扩增引物和PD‑L1扩增引物。应用本发明专利技术的试剂盒或方法，可以从RNA水平进行检测PD‑1/PD‑L1表达水平，对于无法用常规IHC(免疫组化，immunohistochemistry，IHC)检测的癌症病人的组织样本，特别是组织保存液浸泡过的组织样本或者是穿刺样本，本发明专利技术能够实现对这些样本PD‑1/PD‑L1表达水平的检测，主要是因为本发明专利技术的适用范围较广，所需样本量少，只要是能够提取RNA的FFPE样本和组织样本均可进行检测。

【技术实现步骤摘要】
RNA水平检测PD-1和PD-L1表达量的试剂盒及方法
本专利技术涉及生物医学
，具体而言，涉及一种RNA水平检测PD-1和PD-L1表达量的试剂盒及方法。
技术介绍
随着国家食品药品监督总局(CFDA)正式批准国内首个PD-1抑制剂纳武单抗的上市，预示着我国进入了免疫治疗新时代。肿瘤免疫治疗是通过调动机体自身的免疫系统，增强抗肿瘤免疫力，从而抑制和杀伤肿瘤细胞，它的出现改变了肿瘤传统的手术治疗、放化疗的格局，是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一。在肿瘤细胞和免疫效应细胞的相互作用中，肿瘤细胞表面的程序化死亡受体的配体(programmedcelldeath-ligand1，PD-L1)与免疫效应细胞(T淋巴细胞)表面的程序化死亡受体-1(programmedcelldeath-1，PD-1)的结合，传递免疫抑制信号，是肿瘤细胞逃避淋巴细胞杀伤的重要机制。研究表明，PD-1/PD-L1在多种肿瘤组织中发生明显表达上调，是一种广泛表达的生物标志物。以PD-1及PD-L1为靶点的免疫抑制剂，可以阻断PD-1与PD-L1的结合，阻断负向调控信号，使T细胞恢复活性，增强对抗肿瘤生长、转移的能力。因此，用合适的检测方法筛选出肿瘤组织或细胞高度表达PD-1/PD-L1的癌症患者，以便针对性的进行靶向药物的治疗，具有十分重要的临床意义。目前，PD-1/PD-L1的检测主要基于蛋白水平，临床实验中以免疫组化的方法(Immunohistochemistry，IHC)为主，即对手术或穿刺后取得的肿瘤组织进行切片染色，抗体着色后，根据颜色深浅来判断表达情况。由此可知，除染色技术及条件外，抗体的特异性及病理评价标准也尤其重要，这些因素的存在导致现有检测试剂盒存在灵敏度低，特异性不高，稳定性差等缺点，使得我国PD-1/PD-L1的检测市场较为混乱，检测价值偏低。因此，临床上急需统一的可量化的检测方法筛选出高度表达PD-1/PD-L1的肿瘤患者，为个性化地免疫治疗提供指导和依据。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种RNA水平检测PD-1和PD-L1表达量的试剂盒及方法，以解决现有技术中免疫组化检测灵敏度低、特异性不高、稳定性差的技术问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种RNA水平检测PD-1和PD-L1表达量的试剂盒。该试剂盒包括：看家基因扩增引物、PD-1扩增引物和PD-L1扩增引物。进一步地，看家基因扩增引物扩增的看家基因包括GUSB、HMBS、G6PD、POLR2A、ABCF1、TFRC、TBP、SDHA、TUBB和LMNA。进一步地，看家基因扩增引物、PD-1扩增引物和PD-L1扩增引物均为按照跨外显子引物设计的原则设计的多重PCR引物。进一步地，PD-1扩增引物为SEQIDNO：1～3和SEQIDNO：37～39所示的核苷酸序列，PD-L1扩增引物为SEQIDNO：4～6和SEQIDNO：40～42所示的核苷酸序列，看家基因扩增引物为SEQIDNO：7～36和SEQIDNO：43～72所示的核苷酸序列。进一步地，试剂盒还包括反转录混合液、反转录酶、第一文库扩增混合液、第二文库扩增混合液、引物P5、引物P7、纯化磁珠和pH＝8的IDTE缓冲液。进一步地，反转录混合液包括：80mMKCl、200mMpH＝8tris-HCl、20mMMgSO4、每种dNTP共10mM和20μM反转录随机引物；优选的，第一文库扩增混合液包括：80mMKCl、200mMpH＝8tris-HCl、20mMMgSO4、每种dNTP共2mM和酶活力50U的TaqDNA聚合酶；优选的，第二文库扩增混合液包括：80mMKCl、200mMpH＝8tris-HCl、20mMMgSO4、每种dNTP共2mM和酶活力200U的TaqDNA聚合酶；优选的，反转录随机引物为12bp的多聚胸腺嘧啶。根据本专利技术的另一方面，提供了一种RNA水平检测PD-1和PD-L1表达量的方法。该方法采用上述任一种试剂盒进行检测。进一步地，包括以下步骤：S1，提取待测样本中的RNA并反转录为cDNA；S2，以cDNA为模板特异性扩增看家基因、PD-1基因和PD-L1基因；S3，构建测序文库并进行测序；以及S4，对测序数据进行分析，得到PD-1和PD-L1表达量。进一步地，S4中对测序数据进行分析中，PD-1和PD-L1表达量是根据看家基因的测序数据量的倍数的中位数进行标准化，得到NRPM值。进一步地，S4中，若取待测样本的靶基因PD-L1的NRPM低于50则判为阴性样本，反之判为阳性样本。应用本专利技术的试剂盒或方法，可以从RNA水平进行检测PD-1/PD-L1表达水平，对于无法用常规IHC(免疫组化，immunohistochemistry，IHC)检测的癌症病人的组织样本，特别是组织保存液浸泡过的组织样本或者是穿刺样本，本专利技术能够实现对这些样本PD-1/PD-L1表达水平的检测，主要是因为本专利技术的适用范围较广，所需样本量少，只要是能够提取RNA的FFPE样本和组织样本均可进行检测。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1示出了实施例1中12个基因在人群基线的NRPM分布图。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。为了克服现有IHC检测PD-1/PD-L1表达的不足，本专利技术提供一系列在RNA水平检测PD-1和PD-L1表达量的试剂盒及方法。主要专利技术构思如下：与传统IHC在蛋白水平检测PD-1/PD-L1表达相比，RNA水平检测PD-1/PD-L1表达量的原理是先将从癌症患者处取得的组织或FFPE样本进行RNA提取，RNA反转录成cDNA后，用引物对其进行扩增，所得的扩增子用含有特异性序列的引物，进一步扩增后上机测序，测序数据与预设的基线对比，判定最终该患者PD-1/PD-L1表达量情况。根据本专利技术一种典型的实施方式，提供一种RNA水平检测PD-1和PD-L1表达量的试剂盒。该试剂盒包括：看家基因扩增引物、PD-1扩增引物和PD-L1扩增引物。应用本专利技术的试剂盒，可以从RNA水平进行检测PD-1/PD-L1表达水平，对于无法用常规IHC(免疫组化，immunohistochemistry，IHC)检测的癌症病人的组织样本，特别是组织保存液浸泡过的组织样本或者是穿刺样本，本专利技术能够实现对这些样本PD-1/PD-L1表达水平的检测，主要是因为本专利技术的适用范围较广，所需样本量少，只要是能够提取RNA的FFPE样本和组织样本均可进行检测。优选的，看家基因扩增引物扩增的看家基因包括GUSB、HMBS、G6PD、POLR2A、ABCF1、TFRC、TBP、SDHA、TUBB和LMNA，这些看家基因表达稳定，可以在后续测序数据分析时作为参照进行PD-1/PD-L1表达水平的判定。优选的，看家基因扩增引物、PD-1扩增引物和PD-L1扩增引物均为按照跨外显子引物设计的原则设计的多重PCR引物，以排除DNA干扰，可通过多重PCR扩增，优选的扩增得到约110bp的扩增子。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RNA水平检测PD‑1和PD‑L1表达量的试剂盒，其特征在于，包括：看家基因扩增引物、PD‑1扩增引物和PD‑L1扩增引物。

【技术特征摘要】
1.一种RNA水平检测PD-1和PD-L1表达量的试剂盒，其特征在于，包括：看家基因扩增引物、PD-1扩增引物和PD-L1扩增引物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述看家基因扩增引物扩增的看家基因包括GUSB、HMBS、G6PD、POLR2A、ABCF1、TFRC、TBP、SDHA、TUBB和LMNA。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述看家基因扩增引物、PD-1扩增引物和PD-L1扩增引物均为按照跨外显子引物设计的原则设计的多重PCR引物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PD-1扩增引物为SEQIDNO：1～3和SEQIDNO：37～39所示的核苷酸序列，所述PD-L1扩增引物为SEQIDNO：4～6和SEQIDNO：40～42所示的核苷酸序列，所述看家基因扩增引物为SEQIDNO：7～36和SEQIDNO：43～72所示的核苷酸序列。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反转录混合液、反转录酶、第一文库扩增混合液、第二文库扩增混合液、引物P5、引物P7、纯化磁珠和pH＝8的IDTE缓冲液。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录混合液包括：80mMKCl、200mMpH＝8tris-HCl、20mMMgSO4、每种dNTP共...

【专利技术属性】
技术研发人员：林小静，陈敏浚，颜林林，侯军艳，何骥，杜波，陈维之，
申请(专利权)人：臻悦生物科技江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32