检测基因突变的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种检测基因突变的引物、试剂盒及方法。该引物包括上游引物和下游引物，上游引物包括依次相连的通用扩增序列、荧光探针序列以及目的片段上游特异性扩增序列；下游引物包括目的片段的下游特异性扩增序列；目的片段上游特异性扩增序列是区分野生型目的片段与突变型目的片段的特异性扩增序列。将探针设计在目的片段特异性扩增序列的上游，使得目的片段长度可以按需缩短，提高了对血浆cfDNA类样本的利用率和临床应用价值。而在荧光探针序列的上游同时设置通用扩增序列，不仅方便后续扩增，减少整体引物的用量，进而避免整体引物所需用量太大而导致的扩增特异性降低，而且通用扩增序列的存在还有助提高该引物使用的通用性。

【技术实现步骤摘要】
检测基因突变的引物、试剂盒及方法
本专利技术基因检测领域，具体而言，涉及一种检测基因突变的引物、试剂盒及方法。
技术介绍
目前，检测基因的样本可以是新鲜的组织样本、石蜡包埋的组织样本或者是血浆样本，比如血浆中的游离碎片DNA(cfDNA)。而常用的检测基因突变的方法有高通量测序法和ARMS-PCR法。这两种方法在检测200bp以上的目的片段时比较有优势，但在检测小于200bp的较短片段，比如在检测DNA片段长度主要是166bp左右的血浆样本时，都存在各自的缺点。其中，高通量测序法的缺点是检测时间比较长，操作比较繁琐，而且高通量测序法由于受建库连接效率的影响，目前市面上最好的建库试剂盒文库的连接转化率也仅在20-30％之间，照此计算，对血浆cfDNA这类小于200bp的片段而言，大于70％的DNA片段不能被高通量测序法所利用。比如，cSMART技术，建库损失大部分血浆cfDNA片段，成环又只有不到20％文库能被环化作为后期扩增的模板，所以这种方法前后要扩增40-50个循环，检测的真实性存疑，实验可重复性很差。而传统的ARMS-PCR法，其最初主要是针对非血浆样本设计的，上下游引物与中间Taqman探针加在一起至少100bp以上，本来血浆的cfDNA片段长度主要是166bp左右，所以传统ARMS-PCR对血浆cfDNA片段的利用率也不高。若扩增片段接近200bp，则很少的DNA片段能被利用。因而，针对像血浆cfDNA片段大小的样本进行基因突变检测时，上述两种方法都未考虑DNA片段的利用率，而仅片面强调检测的灵敏度和准确性，这样的检测是不可靠的。尤其是利用血浆cfDNA检测与疾病(如肿瘤)相关的位点时，可靠性则更低，临床应用价值受限。因此，仍需要对现有的检测手段进行改进，以提供一种适用于针对像血浆cfDNA片段大小的一类样本的基因突变检测。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种检测基因突变的引物、试剂盒及方法，以适用于对血浆cfDNA类样本的突变检测。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种检测基因突变的引物，该引物包括上游引物和下游引物，上游引物包括依次相连的通用扩增序列、荧光探针序列以及目的片段上游特异性扩增序列；下游引物包括目的片段的下游特异性扩增序列；其中，目的片段上游特异性扩增序列是区分野生型目的片段与突变型目的片段的特异性扩增序列。进一步地，荧光探针序列为通用荧光探针序列。进一步地，目的片段上游特异性扩增序列与野生型目的片段之间存在至少两个错配碱基，且其中一个错配碱基即为目的片段上游特异性扩增序列的3’末端碱基，记作最末端错配碱基。进一步地，最末端错配碱基的错配类型属于以下任意一种：A-A、G-G、C-C、A-G及G-A，与最末端错配碱基相邻的倒数第二位碱基为错配碱基，记作末端第二错配碱基；优选地，末端第二错配碱基为与野生型目的片段上对应的碱基相同的碱基，或者为与突变型目的片段上对应的碱基相同的碱基。进一步地，最末端错配碱基的错配类型属于以下任意一种：C-T、T-C、G-T、T-G、A-C、C-A及T-T，与最末端错配碱基相邻的倒数第二位和第三位碱基为错配碱基，记作末端第二错配碱基和末端第三错配碱基；优选地，末端第二错配碱基和末端第三错配碱基均为与野生型目的片段上对应的碱基相同的碱基，或者均为与突变型目的片段上对应的碱基相同的碱基。为了实现上述目的，根据本专利技术的第二个方面，提供了一种检测基因突变的试剂盒，试剂盒包括上述任一种检测基因突变的引物。进一步地，试剂盒还包括通用探针，通用探针与荧光探针序列相同；优选地，试剂盒还包括通用扩增引物，通用扩增引物的序列与通用扩增序列相同。进一步地，试剂盒还包括封闭序列，封闭序列为与野生型目的片段完全互补的序列。根据本申请的第三方面，提供了一种检测基因突变的方法，方法包括采用上述任一种引物进行扩增检测，或者采用上述任一种试剂盒进行检测。应用本专利技术的技术方案，通过将探针改进设计在上游引物上并位于目的片段特异性扩增序列的上游，不受待扩增的目的片段长度的限制，使得所扩增的目的片段长度可以按需缩短，因而能够用于对血浆cfDNA这类模板DNA小于200bp的样本进行基因扩增检测，而且能大大提高这类样本的利用率。而在荧光探针序列的上游同时设置通用扩增序列，不仅方便后续扩增，减少整体引物的用量，进而减少整体引物所需用量太大而导致的扩增特异性降低，而且通用扩增序列的存在还有助提高该引物使用的通用性。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1示出了传统的ARMS-PCR进行基因检测的原理示意图；图2示出了本申请的改进的ARMS-PCR基因检测的原理示意图；图3示出了根据本申请优选实施例中的改进引物结构示意图；图4示出了实施例1中利用改进的引物对Braf基因V600EC不同突变体含量的标准品的检测结果；图5示出了实施例2中利用改进的引物对Braf基因V600E位点在10％突变体、野生型和空白对照中的检测结果；图6示出了实施例2中利用改进的引物对Braf基因V600EC位点在10％突变体、野生型和空白对照的检测结果；图7示出了实施例2中利用改进的引物对Braf基因V600D位点在10％突变体、野生型和空白对照的检测结果；图8示出了实施例2中利用改进的引物对Braf基因V600K位点在10％突变体、野生型和空白对照中的检测结果；图9示出了实施例2中利用改进的引物对Braf基因V600R位点在10％突变体、野生型和空白对照中的检测结果。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本专利技术。如
技术介绍
部分所提到的，现有的高通量测序方法和ARMS-PCR的方法均不适合对类似血浆cfDNA大小的样本进行基因突变检测，不能最大限度的利用血浆片段DNA，为了改善现有技术这一现状，本申请的专利技术人对ARMS-PCR的方法进行了深入的研究和改进，发现传统的ARMS-PCR的结构如附图1所示，包括两端的上下游引物(左边的箭头表示上游引物，右边的箭头表示下游引物)和中间的Taqman探针(两头圆点的短线表示探针)。由于为了找到合适的位置(片段上有黑色方块标注的表示含有突变位点的模板)，一般设计长度都在100bp以上，或者更长，所以能够被利用的血浆cfDNA片段不到总数的30％。针对上述情况，专利技术人对传统ARMS-PCR进行了改进，改进的结构如图2所示(图注的涵义同图1)，与Taqman探针对应的探针序列不在上下游引物的中间，而是作为上游引物的一部分，设计在了上游引物的侧臂上，这样扩增的片段就可以缩小到40～60bp之间。为了实现该目标，上游的特异引物需要包含三个部分，3’端是检测和区分野生型和突变型的扩增特异引物(该位点的碱基与突变型碱基互补配对，而不能与野生型碱基互补配对)，中间是对应于Taqman探针的探针区域，5’端是通用扩增引物。该改进的特点是将所有扩增片段长度设计都控制在60bp以内，所得扩增片段长度在50bp左右，至少能够保证有70％的血浆cfDNA片段被利用，从而实现最大限度利用血浆cfDNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测基因突变的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括依次相连的通用扩增序列、荧光探针序列以及目的片段上游特异性扩增序列；所述下游引物包括所述目的片段的下游特异性扩增序列；其中，所述目的片段上游特异性扩增序列是区分野生型目的片段与突变型目的片段的特异性扩增序列。

【技术特征摘要】
1.一种检测基因突变的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括依次相连的通用扩增序列、荧光探针序列以及目的片段上游特异性扩增序列；所述下游引物包括所述目的片段的下游特异性扩增序列；其中，所述目的片段上游特异性扩增序列是区分野生型目的片段与突变型目的片段的特异性扩增序列。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述荧光探针序列为通用荧光探针序列。3.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于，所述目的片段上游特异性扩增序列与所述野生型目的片段之间存在至少两个错配碱基，且其中一个错配碱基即为所述目的片段上游特异性扩增序列的3’末端碱基，记作最末端错配碱基。4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，所述最末端错配碱基的错配类型属于以下任意一种：A-A、G-G、C-C、A-G及G-A，与所述最末端错配碱基相邻的倒数第二位碱基为错配碱基，记作末端第二错配碱基；优选地，所述末端第二错配碱基为与所述野生型目的片段上对应的碱基相同的碱基，或者为与所述突变型目的片段上对应的碱基相同的碱基。5.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙培，
申请(专利权)人：北京昱晟达医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11