一种肥胖基因突变的诊断试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，针对肥胖相关致病基因编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补原则设计探针序列，在每个探针序列的连接接头，采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸大规模合成，用氨水将芯片上的寡核苷酸洗脱形成寡核苷酸混合物，通过PCR的方法，采用5’端带有生物素标记的引物，形成带生物素标记的肥胖相关致病基因DNA探针文库。本发明专利技术实现对肥胖相关的已知位点的高通量筛查方法及应用，比单独进行位点筛查和全基因组或者全外显子测序的检测更快速、更经济和简便，且对设备及环境要求低，可在与肥胖相关的已知核基因的多态性位点中的应用，适用于肥胖相关人群的大规模筛查和预防性检查。

【技术实现步骤摘要】
一种肥胖基因突变的诊断试剂盒及应用
本专利技术属于生命科学与生物
，具体涉及一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，以及利用该试剂盒在检测与人肥胖相关的核基因的多态性位点中的应用。
技术介绍
肥胖是指一定程度的明显超重与脂肪层过厚，是体内脂肪，尤其是甘油三酯积聚过多而导致的一种状态。它不是指单纯的体重增加，而是体内脂肪组织积蓄过剩的状态。由于食物摄入过多或机体代谢的改变而导致体内脂肪积聚过多造成体重过度增长并引起人体病理、生理改变或潜伏。认为遗传因素在肥胖形成过程中起着重要作用。父母中有一人肥胖，则子女有40％肥胖的机率，如果父母双方皆肥胖，子女可能肥胖的机率升高至70％～80％。肥胖对人体损伤极大，增加心血管疾病的危险，肥胖影响消化系统的功能，肥胖影响内分泌系统的功能，肥胖增加癌症发生的危险性，肥胖不仅影响形体美，而且给生活带来不便。此外还有关节软组织损伤、生殖能力下降以及心理障碍、心脏病、糖尿病、动脉粥样硬化、脂肪肝、胆结石、水肿、痛风等。随着高通量测序技术的发展与成熟，人全基因组测序已经成为肥胖相关致病基因突变研究和诊断的重要工具。通过全基因组测序对被测样本进行全基因组扫描，可实现对基因突变零遗漏，从而成为肥胖相关致病基因突变研究和诊断的有效工具。由于人类基因组的大小约为3Gb，对其进行全基因组测序总计约需90Gb测序数据。巨大的数据量要求所致高昂的测序成本，导致全基因组测序应用于肥胖的基因诊断受到限制。全基因组测序和全外显子测序需要产生大量的测序数据量，测序成本高，因此测序深度不可能太深。对于检查基因突变而言，想要实现突变检查的零遗漏，全基因组测序确实难以担当此任。特别是对于，一次检测数百个基因上发生的所有突变，高深度测序才能实现对突变检测的准确性。因此，开发一款价格低廉的，准确性高的基因突变检查产品，特别是对于肥胖基因突变的诊断产品，具有重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前检测肥胖相关的目的基因的方法所存在的缺点，提供一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，是一种通过构建具有快速、高通量特点，更好的有利于高效、快速、便捷、经济的进行肥胖相关的目的区域DNA全序文库，从而进行高通量测序的一种试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，通过制备带生物素标记的肥胖相关基因DNA探针文库构成，主要由全基因组DNA打断后的加A尾的体系、接头连接体系、纯化体系、PCR前反应体系、探针杂交体系、PCR后反应体系等6个组分构成，具体通过以下步骤实现：(1)针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为100bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3，共计535个基因；(2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT和GTGACTGGAGTTCAGACGTG序列及特异性样本识别序列，形成两端带有接头序列；(3)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下列，形成寡核苷酸混合物。(4)通过PCR的方法，采用5’端均带有生物素标记的正向引物TTAGATAGGTGTGTAGGCGC和反向引物TAAGGTGCGTACTAGCTGAC，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的基因DNA探针文库。其中PCR条件：热盖105℃，95℃5min，65℃延伸保存。本专利技术对带有样本识别序列的接头探针，采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下列，形成寡核苷酸混合物。本专利技术所述基因选自表1中示出的肥胖相关致病基因535个，例如表1中的所有基因。本专利技术所述探针序列的长度为100bp，所述探针在每两个相邻的探针序列之间存在60bp或80bp的重叠，共计535个基因。本专利技术所述基因选自表3中示出的肥胖相关靶向捕获致病基因，例如表3中的所有基因。本专利技术的另一个目的是提供所述试剂盒在检测人肥胖相关的核基因的多态性位点，通过以下步骤实现：1)根据人类参考基因组HG19，结合Ensembl、CCDS、Gencode、VEGA、SNP以及CytoBand数据库，获取实施例2表1中耳聋相关致病基因的所有编码序列；2)提取所述受试者的基因组DNA，将其打断至200-300bp的范围；3)针对每个编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为90bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在60bp或者80bp的重叠；4)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加序列和测序识别序列接头，形成两端带有同样序列的探针序列96条序列表的第5-100号，5)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列列表中的序列；6)通过PCR的方法，采用5’端带有生物素标记的正向引物TTAGATAGGTGTGTAGGCGC和5’端带有同样标记的反向引物TAAGGTGCGTACTAGCTGAC，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的耳聋相关致病基因DNA探针文库。反应体系如下：试剂名称体积2GBufferB5×10μldNTP(10mMeach)1μl正向引物(25μM)0.5μl反向引物(25μM)0.5μl寡核苷酸混合物5μl2GrobustDNATaq0.8μlH2O32.2μl反应条件如下：7)对步骤4)获得的扩增产物进行上机测序，得到所述基因的测序数据；8)将步骤5)的测序数据与人类参考基因组进行比对，从而得到与参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失，即所检测到的基因突变。本专利技术提供将人体全基因组进行打断、靶向基因捕获芯片、探针以及相关的检测试剂盒。本专利技术主要提供了：(1)对人基因组DNA打断后的接头连接探针；(2)提供肥胖相关的靶向基因捕获芯片；(3)捕获目标区域DNA文库的纯化和扩增；(4)一种用于靶向捕获肥胖相关目标区域基因的二代测序文库构建的方法及试剂盒。本专利技术的试剂盒具有如下优点：(1)相对于全基因组测序，大大节约了所需要的测序数据量；(2)一次性检测疾病相关致病基因的所有突变，实现对疾病基因诊断的零遗漏，为疾病的治疗和干预提供保障；(3)高深度的测序，实现对基因突变的高准确性检测；(4)成本低，一次检测数百个基因上发生的所有突变；应用本专利技术提供的试剂盒进行mtDNA突变检测，成本较其他检测方法更低；检测流程简便、快速，结果判读直观；适合在一般医院、分子生物实验室开展，便于在全国范围内特别是欠发达地区实行遗传性视神经病变相关的mtDNA突变的大规模筛查和预防性检查。(5)高深度测序实现对突变检测的准确性。附图说明图1是本专利技术的肥胖基因靶向捕获DNA文库构建示意图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。实施例1本专利技术一种肥胖基因突变的诊断试剂盒及制备方法本专利技术提供的诊断试剂盒，通过以下制备步骤实现：1)针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为100bp的探针序列，并且每两个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为100bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3，共计535个基因；(2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加SEQ:NO.1和SEQ:NO.2序列，形成两端带有接头序列；(3)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，形成寡核苷酸混合物；(4)通过PCR的方法，采用5’端均带有生物素标记的正向引物TTAGATAGGTGTGTAGGCGC和反向引物TAAGGTGCGTACTAGCTGAC，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的基因DNA探针文库。其中PCR条件：热盖105℃，95℃5min，65℃延伸保存。

【技术特征摘要】
1.一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为100bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3，共计535个基因；(2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加SEQ:NO.1和SEQ:NO.2序列，形成两端带有接头序列；(3)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，形成寡核苷酸混合物；(4)通过PCR的方法，采用5’端均带有生物素标记的正向引物TTAGATAGGTGTGTAGGCGC和反向引物TAAGGTGCGTACTAGCTGAC，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的基因DNA探针文库。其中PCR条件：热盖105℃，95℃5min，65℃延伸保存。2.根据权利要求1所述的一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，其特征在于，方法步骤(1)中的所述探针序列的长度为100bp，所述探针在每两个相邻的探针序列之间存在60bp或80bp的重叠。3.根据权利要求1所述的一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，其特征在于，方法步骤(3)中采用寡核苷酸原位...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅君芬，冀延春，王金玲，赵宁宁，管敏鑫，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33