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一种用于宫颈病变预警的指标及其诊断试剂盒制造技术

技术编号:20885362 阅读:29 留言:0更新日期:2019-04-17 13:34
本发明专利技术公开了一种用于宫颈病变预警的指标及其诊断试剂盒,其特征是将Piwil2作为宫颈病变预警的特异指标,并用于制备宫颈病变的诊断试剂盒。采用Piwil2特异的抗体或核酸探针,直接或间接标记荧光基团、化学发光基团、放射性核素、酶或胶体金,基于采用酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫、固相膜免疫、放射免疫、免疫组织化学技术,或定量聚合酶链反应(Q‑PCR)、原位杂交技术(ISH)、液相杂交技术,分别对宫颈脱落细胞、宫颈活检组织或手术切除的宫颈组织中Piwil2蛋白和mRNA进行检测,用于宫颈病变筛查、分流、诊断和预后判断。

【技术实现步骤摘要】
一种用于宫颈病变预警的指标及其诊断试剂盒
本专利技术涉及临床诊断
,具体地说,涉及一种用于宫颈病变筛查、分流、诊断和预后判断的指标及其诊断试剂盒。
技术介绍
高危型人乳头瘤病毒(highriskHPV)持续感染导致宫颈上皮细胞发生病变,经过一个连续、渐进的过程,包括子宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)1、2、3阶段,最终发展为宫颈癌,大约需要10年左右的时间。宫颈癌病因明确、较长的癌前病变阶段等特点为早期病变筛查、诊断、治疗提供了充足的时间,一定意义上说宫颈癌是可防可治的。因此,敏感、特异的诊断方法尤其重要。目前,临床常用的筛查方法主要为宫颈脱落细胞学和HPVDNA检测。其中,宫颈脱落细胞学检查受取材、制片及染色质量,阅片医师的业务水平、工作状态等诸多因素影响,其敏感性较差,漏诊率较高。HPVDNA检测一般采用荧光定量PCR或导流杂交法分型,灵敏度很高,但是特异性不尽人意。因为,女性一生中可能会多次感染HPV,其中大多数个体可以自行清除病毒,仅为一过性感染,只有HPV持续存在并与宿主DNA发生整合才会引起细胞病变。HPVDNA检测只能反映当次样本中HPV情况,无法区分病毒DNA整合和一过性感染,加之目前没有很好的抗HPV药物,HPVDNA检测阳性结果会造成医生向患者解释困难及患者心理恐慌,导致过度医疗。目前的临床诊疗规范认为,CIN1中57%-60%可以自然消退和逆转,主要以随访监测为主,但是有持续进展的风险;CIN2/3则属于高级别癌前病变,需要及时处理,一般采用消融或切除治疗,但其中约32%-43%仍然可以自然逆转,并且手术切除会导致宫颈机能不全等并发症,对患者身体和心理造成伤害,且仍存在复发风险。鉴于此,确立一个高度特异的指标,用于宫颈病变的诊断、手术指征的确认、及病变预后的判断,将使众多女性获益,给临床医生带来便利,同时也为社会节约了医疗资源。目前的肿瘤标志物基本都是肿瘤发生后,由肿瘤细胞异常产生或机体对肿瘤刺激反应产生的物质,其出现滞后于肿瘤细胞的形成,且缺乏特异性。Piwil2属于PIWI/AGO家族成员,具有高度进化保守性,胚胎时期主要在胚胎干细胞和生殖干细胞表达,出生后仅生精细胞表达Piwil2,其他正常组织器官,包括宫颈组织,均无表达。但是在不同组织来源的肿瘤细胞系、临床肿瘤组织Piwil2表达阳性。我们还发现,Piwil2还具有通过表观遗传途径上调转录因子c-myc、nanog、sox2、oct4和klf4的表达,使正常成体细胞发生重编程而转化为肿瘤起始细胞的作用。因此,Piwil2既是一种重要的肿瘤睾丸抗原,也是细胞恶性转化的关键效应分子。
技术实现思路
本专利技术是为了解决上述现有技术存在的不足,提供一个用于宫颈疾病诊断的标志物及诊断试剂盒,特异检测宫颈病变组织、宫颈脱落细胞中Piwil2蛋白和mRNA的表达水平,为提高诊断特异性,准确判断病变进展风险、分流患者、预后评价,从而精准治疗,节约医疗资源。本专利技术为解决技术问题采用如下技术方案:本专利技术一种用于宫颈病变预警的指标及其诊断试剂盒,其特点是:Piwil2作为宫颈病变预警的指标,并用于制备宫颈病变的诊断试剂盒;所述诊断试剂盒,可采用Piwil2特异性抗体基于免疫学技术检测Piwil2蛋白表达,也可按照Piwil2全基因组序列设计特异性核酸探针,基于分子生物学技术检测Piwil2的mRNA表达,根据Piwil2蛋白和mRNA检测结果用于宫颈病变筛查、分流、诊断和预后判断;所述诊断试剂盒中Piwil2特异性抗体可直接偶联或通过其对应的二抗偶联用于检测的荧光基团、化学发光基团、放射性核素、酶或胶体金;所述诊断试剂盒中Piwil2特异性核酸探针可直接偶联荧光基团、化学发光基团、放射性核素、酶,原位显示宫颈脱落细胞和宫颈组织中Piwil2mRNA表达;或者首先从宫颈脱落细胞和宫颈组织中提取Piwil2mRNA,再逆转录为cDNA,最后通过聚合酶链反应(PCR),对Piwil2的mRNA进行扩增;诊断试剂盒中Piwil2蛋白检测可采用酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫、固相膜免疫、放射免疫、免疫组织化学技术,Piwil2的mRNA检测可采用定量聚合酶链反应(Q-PCR)、原位杂交技术(ISH)、液相杂交技术;所述诊断试剂盒中Piwil2蛋白或mRNA表达的定性和定量是通过检测偶联的荧光基团、化学发光基团、放射性核素、酶或胶体金,在反应结束后反应体系中光强度、射线强度、吸光度或颜色变化而直接或间接获得。本专利技术一种用于宫颈病变预警的指标及其诊断试剂盒,其特点也在于,宫颈病变特指CIN1、CIN2、CIN3和宫颈浸润癌,临床标本取材是宫颈脱落细胞、宫颈活检组织、手术切除的宫颈组织。与已有技术相比,本专利技术有益效果体现在:本专利技术一种用于宫颈病变预警的指标及其诊断试剂盒,可以特异诊断宫颈病变、评价病变进展风险、评估预后。与液基细胞学检查联合,对于细胞学诊断为意义不明确的非典型鳞状细胞癌(ASC-US)、非典型鳞状细胞癌不能排除高级别病变(ASC-H)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)及非典型腺细胞(AGC),可以进一步明确诊断和分流阴道镜检查,避免患者恐慌和过度检查;与HPVDNA检查联合,可以准确判断高危型HPVDNA是否与宿主基因组整合,提高前者诊断的特异性;与组织病理学检查联合,可以预测病变进展风险,明确手术指征,避免漏诊或过度治疗。附图说明图1为Piwil2在不同级别宫颈病变组织中的表达结果分析图;图2为原位检测Piwil2表达的模式图;图3为定量检测液相中Piwil2蛋白水平的模式图;图4为定量检测液相中Piwil2mRNA水平的模式图;图中标号:1Piwil2蛋白,2Piwil2一抗,3二抗,4标记基团,5Piwil2mRNA,6核酸探针,7探针标记物,8探针标记物抗体,9Piwil2捕获抗体,10Piwil2检测抗体,11Piwil2mRNA对应cDNA,12PCR扩增产物。具体实施方式实施例1Piwil2在临床宫颈组织标本中的表达比较,包括23例正常宫颈组织、13例CIN1、34例CIN2/3和30例宫颈癌选取23例正常宫颈组织、13例CIN1、34例CIN2/3和30例宫颈癌组织的病理蜡块,常规切片、脱蜡、水化,采用Piwil2特异性抗体进行免疫组织化学染色,在光学显微镜下分别进行染色强度评分:阴性计0分,弱阳性计1分,阳性计2分,强阳性计3分;及阳性面积评分:阴性计0分,<10%计1分,11%-50%计2分,51%-80%计3分,>80%计4分;最终得分采用染色强度评分乘以阳性面积评分。应用SPSS13.0软件t检验模块进行组间差异比较,Spearman模块进行相关分析,结果显示(图1)Piwil2表达与临床诊断黄金标准-组织病理学结果一致,并且13例ClN1中有4例出现弱阳性,提示病变有进展风险。实施例2宫颈脱落细胞或组织切片原位检测Piwil2表达(图2)采集宫颈脱落细胞,常规固定、在防脱载玻片上制成细胞涂片;活检或手术切除的宫颈组织常规固定、制成石蜡切片,脱蜡并水化;再采用0.5%TritonX100在细胞膜上打孔,PBS洗涤3次;检测Piwil2蛋白(1):加上Pi本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种用于宫颈病变预警的指标及其诊断试剂盒,其特征是:Piwil2作为宫颈病变预警的指标,并用于制备宫颈病变诊断试剂盒。

【技术特征摘要】
1.一种用于宫颈病变预警的指标及其诊断试剂盒,其特征是:Piwil2作为宫颈病变预警的指标,并用于制备宫颈病变诊断试剂盒。2.根据权利要求1所述的一种用于宫颈病变预警的指标及其诊断试剂盒,其特征在于,制备的诊断试剂盒可以基于特异性抗体检测Piwil2蛋白表达,或基于特异性核酸探针检测Piwil2的mRNA表达,用于宫颈病变筛查、分流、诊断和预后判断。3.根据权利要求2所述的一种用于宫颈病变预警的指标及其诊断试剂盒,其特征在于,所述Piwil2特异性抗体可直接偶联或通过其对应的二抗偶联用于检测的荧光基团、化学发光基团、放射性核素、酶或胶体金;Piwil2特异性核酸探针可直接偶联荧光基团、化学发光基团、放射性核素、酶,或者借助逆转录和聚合酶链反应(PCR),对Piwil2的mRNA进行扩增。4.根据权利要求3所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员:冯子辉章淑青
申请(专利权)人:冯子辉章淑青
类型:发明
国别省市:北京,11

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