一种确定生物体样本中染色体数量是否异常的检测方法技术

一种确定生物体样本中染色体数量是否异常的检测方法，该方法包括以下步骤：确定每种待检测染色体上需要检测的基因种类的最小数量，选择至少一种参比染色体，确定每种待检测染色体上选定已知数量的基因以及每种参比染色体上选定已知数量的基因的拷贝数；和确定样本中待检染色体的数量，从而确定待检染色体数量是否异常。该方法可以精准、并行地检测多种染色体数量的异常情况，对于无创产前筛查13、18、21号染色体三体综合征和X、Y染色体数量异常等重大需求具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种确定生物体样本中染色体数量是否异常的检测方法
本专利技术涉及核酸检测领域，具体涉及一种确定生物体样本中染色体数量是否异常的检测方法。
技术介绍
对于人类而言，染色体的数量变化会引起严重的先天性疾病。目前最常见的是第21号染色体由正常的二倍体变化为异常的三倍体，称为先天愚型，发病率约为1/700～1/600。第18号染色体和第13号染色体也会出现类似的数量变化，造成感知、肢体、发育等各方面病变的综合征，发病率分别约为1/2000和1/4000。此外，X染色体和Y染色体的数量变化，也会引起性发育方面的严重问题。最早用于检测染色体数量变化的方法是核型分析，这种方法需要使用羊膜穿刺等介入式取样方法，从母体内取出源于胎儿的细胞，在显微镜下观察细胞核内的染色体构型，从而确定染色体的数量异常情况，这种方法多用于产后对新生儿的诊断。显而易见地，这种介入式的产前筛查方法对于孕妇是一种痛苦，同时也增加了流产的风险。因此，研究者们提出了无创产前诊断的方法。其中一种方法是宫颈刮片，即采取孕妇宫颈处由胎儿脱落的细胞，经过分离纯化(比如使用磁珠富集、免疫和流式分选等方法)后，可以获得纯度较高的胎儿细胞。这种方法的缺点是样品的处理过程较为复杂。另一种更为直接的想法是通过母体外周血内的胎儿游离核酸进行检测。胎儿游离核酸是一些来源于胎儿的、高度片段化的核酸序列。非常有挑战的是，孕妇外周血内的胎儿游离核酸的比例很低，二代测序结果表明，在孕早期时，孕妇外周血内的胎儿游离核酸的比例仅有4％(通过源于男性胎儿的Y染色体上的相关基因确定)。虽然二代测序能以多靶标的形式检测到较低比例的胎儿游离核酸，但是二代测序对核酸和基因拷贝数的定量难以做到非常精准，因而难以分辨出低丰度的胎儿游离核酸中，源于胎儿染色体数量变化导致的该染色体上基因拷贝数的微小变化，尤其是检测第13、18、21号染色体和X染色体的数量变化，因为源于这些染色体的基因普遍存在于母体中，胎儿游离核酸拷贝数的变化对母体外周血内源于母体的基因拷贝数所产生的影响微乎其微。
技术实现思路
为了解决这种由于基因拷贝数精准定量能力不足而导致难以从母体外周血中无创检测胎儿染色体数量异常的问题，本专利技术披露一种染色体数量变化的检测方法。在一种实施方法中，本专利技术提供一种确定生物体样本中染色体数量是否异常的检测方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：根据待检测染色体的数量变化值、样本中的核酸当量和该检测方法的置信度，确定每种待检测染色体上需要检测的基因种类的最小数量，从每种待检测染色体上选定已知数量的基因，所示已知数量不小于所述基因种类的最小数量；所述样本中的核酸当量是指样本中的核酸的质量与所检测的生物体内的全基因组的质量的比值；所述染色体的数量变化值是指在所述生物体的单个基因组中，所有异常情况下所述待检测染色体的数量与正常情况下所述待检测染色体应有的数量之间可能出现的最小绝对差值；步骤2：选择至少一种参比染色体，从每种参比染色体上选定已知数量的基因；步骤3：确定每种待检测染色体上选定已知数量的基因以及每种参比染色体上选定已知数量的基因的拷贝数；和步骤4：根据上述各个基因的拷贝数、参比染色体的数量和待检测染色体的核酸质量在样本核酸质量中的比例，确定样本中待检染色体的数量，从而确定待检染色体数量是否异常。在一种实施方式中，所述生物体为人类，所述参比染色体包括人类第1-7、9-12、14-17、19、20、22号染色体中的一种或多种，优选地为人类第1、2号染色体中的一种或多种，更优选地为人类第1号染色体；所述待测染色体是人类第13号、第18号、第21号、X和Y五种染色体中的一种或多种。在一种实施方式中，根据所述待检测染色体的数量变化值、样本中的核酸当量和和所述检测方法的置信度，计算出所需的最小基因拷贝数；然后，使用所述所需的最小基因拷贝数除以所述核酸当量，得到所述的基因种类的最小数量。在一种实施方式中，确定每种参比染色体上选定已知数量的基因的拷贝数方法包括核酸扩增、特异性杂交和/或测序，优选地为聚合酶链反应、环介导等温扩增、滚环扩增、指数扩增、依赖核酸序列的扩增、微阵列芯片杂交和/或二代测序中的一种或多种，更优选地为液滴数字聚合酶链反应。在一种实施方式中，所述液滴数字聚合酶链反应中使用光学检测、电化学检测、色谱检测、质谱检测和/或测序方法中的一种或多种检测方法；优选地为荧光信号检测、凝胶电泳色谱检测、毛细管电泳测序和/或二代测序中的一种或多种；更优选地，每种染色体上的基因的聚合酶链反应产生相同种类的荧光信号，不同染色体上的基因的聚合酶链反应产生不同种类的荧光信号。在一种实施方式中，在确定所述基因拷贝数时，首先对于每种荧光信号，根据荧光信号的强度将液滴分为两类：其中第一类液滴为不含有所述基因的液滴；第二类液滴为含有一种或多种所述基因的液滴；然后，根据所述液滴数字聚合酶链反应的统计学模型确定所述基因拷贝数定，所述的统计学模型包括二项分布模型、泊松分布模型、正态分布模型、卡方分布模型、伽马分布模型、F分布模型和/或马歇尔-帕尔默分布模型中的一种或多种，优选地为二项分布模型和/或泊松分布模型中的一种或多种；更优选地，使用泊松分布模型计算所述基因拷贝数，其中第一类液滴的数量为N，第二类液滴的数量为P，则所述染色体上的基因总拷贝数为-ln[1-P/(P+N)]。在一种实施方式中，待检测染色体的数量tj＝(Σi{[Bj-kjiAi×(1-f)]×qi}×Σikji/ΣiAi/f/m),j＝1,2,…,n，其中A代表参比染色体的未归一化数量，其是所述参比染色体上的所述基因的总拷贝数除以单个相应的参比染色体上的所述基因的总拷贝数，第i种参比染色体的未归一化数量为Ai,i＝1,2,…,m，m为参比染色体数量；B代表待检测染色体的未归一化数量，其是所述待检测染色体上的基因的总拷贝数除以单个相应的待检测染色体上的所述基因的总拷贝数，Bj代表第j种待检测染色体的未归一化数量，j＝1,2,…,n，n为待检测染色体数量；kji为正常情况下在所述生物体的单个基因组上第j种待检测染色体的数量与第i种参比染色体的数量的比值，qi为正常情况下在所述生物体的单个基因组上第i种参比染色体的数量，f为待测染色体的核酸质量在样本核酸质量中所占的比例。在一种实施方式中，将所述待检测染色体的数量四舍五入取整，根据所述取整后待检测染色体的数量和正常情况下待检测染色体的数量的绝对差值，确定所述待检染色体的数量是否异常。采用目前基因拷贝数定量最为精准的液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)方法，该方法不需要依赖传统定量PCR的标准曲线，能够对基因拷贝数进行绝对定量。其次，由于ddPCR的定量结果从统计学原理上就存在一定宽度的置信区间(如Milbury等人的文献报道)，因此即便使用ddPCR方法，如果直接以某种基因的拷贝数代表相应染色体的数量，在区分上述基因拷贝数的变化时仍然颇有挑战。针对这个挑战，本专利技术进一步在每种染色体上选取合适种类数量的不同基因，利用胎儿游离核酸高度片段化的特点(来源于相同染色体的不同基因大概率会在不同的胎儿游离核酸片段上)，增加可用于ddPCR扩增的目标数量，进一步压缩该置信区间的宽度，提高ddPCR对不同基因拷贝数的分辨力，从而实现从母体外周本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定生物体样本中染色体数量是否异常的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1：根据待检测染色体的数量变化值、样本中的核酸当量和该检测方法的置信度，确定每种待检测染色体上需要检测的基因种类的最小数量，从每种待检测染色体上选定已知数量的基因，所示已知数量不小于所述基因种类的最小数量；所述样本中的核酸当量是指样本中的核酸的质量与所检测的生物体内的全基因组的质量的比值；所述染色体的数量变化值是指在所述生物体的单个基因组中，所有异常情况下所述待检测染色体的数量与正常情况下所述待检测染色体应有的数量之间可能出现的最小绝对差值；步骤2：选择至少一种参比染色体，从每种参比染色体上选定已知数量的基因；步骤3：确定每种待检测染色体上选定已知数量的基因以及每种参比染色体上选定已知数量的基因的拷贝数；和步骤4：根据上述各个基因的拷贝数、参比染色体的数量和待检测染色体的核酸质量在样本核酸质量中的比例，确定样本中待检染色体的数量，从而确定待检染色体数量是否异常。

【技术特征摘要】
1.一种确定生物体样本中染色体数量是否异常的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1：根据待检测染色体的数量变化值、样本中的核酸当量和该检测方法的置信度，确定每种待检测染色体上需要检测的基因种类的最小数量，从每种待检测染色体上选定已知数量的基因，所示已知数量不小于所述基因种类的最小数量；所述样本中的核酸当量是指样本中的核酸的质量与所检测的生物体内的全基因组的质量的比值；所述染色体的数量变化值是指在所述生物体的单个基因组中，所有异常情况下所述待检测染色体的数量与正常情况下所述待检测染色体应有的数量之间可能出现的最小绝对差值；步骤2：选择至少一种参比染色体，从每种参比染色体上选定已知数量的基因；步骤3：确定每种待检测染色体上选定已知数量的基因以及每种参比染色体上选定已知数量的基因的拷贝数；和步骤4：根据上述各个基因的拷贝数、参比染色体的数量和待检测染色体的核酸质量在样本核酸质量中的比例，确定样本中待检染色体的数量，从而确定待检染色体数量是否异常。2.根据权利要求1中所述的确定生物体样本中染色体数量是否异常的检测方法，其特征在于：所述生物体为人类，所述参比染色体包括人类第1-7、9-12、14-17、19、20、22号染色体中的一种或多种，优选地为人类第1、2号染色体中的一种或多种，更优选地为人类第1号染色体；所述待测染色体是人类第13号、第18号、第21号、X和Y五种染色体中的一种或多种。3.根据权利要求1中所述的确定生物体样本中染色体数量是否异常的检测方法，其特征在于：根据所述待检测染色体的数量变化值、样本中的核酸当量和和所述检测方法的置信度，计算出所需的最小基因拷贝数；然后，使用所述所需的最小基因拷贝数除以所述核酸当量，得到所述的基因种类的最小数量。4.根据权利要求1中所述的确定生物体样本中染色体数量是否异常的检测方法，其特征在于：确定每种参比染色体上选定已知数量的基因的拷贝数方法包括核酸扩增、特异性杂交和/或测序，优选地为聚合酶链反应、环介导等温扩增、滚环扩增、指数扩增、依赖核酸序列的扩增、微阵列芯片杂交和/或二代测序中的一种或多种，更优选地为液滴数字聚合酶链反应。5.根据权利要求4中所述的确定生物体样本中染色体数量是否异常的检测方法，其特征在于：所述液滴数字聚合酶链反应中使用光学检测、电化学检测、色谱检测、质谱检测和/...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱修锐，祝令香，郭永，陈芊如，王芳，刘宝霞，荆高山，杨文军，高娜，
申请(专利权)人：清华大学，新羿制造科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11