检测FGD1基因突变的引物和方法技术

技术编号:20885330 阅读:29 留言:0更新日期:2019-04-17 13:34
本发明专利技术公开了检测FGD1 659+27T>C和482‑113C>T两个碱基突变的引物和方法;采用Sanger测序技术,可用于快速检测该突变位点。利用本发明专利技术完成的检测结果准确,可以辅助诊断Aarskog综合征患者的基因突变情况。利用本发明专利技术所述引物和方法便于判断和分析产生的基因突变是否会造成Aarskog综合征,对Aarskog综合征的临床鉴别及诊断有重要的参考意义。

【技术实现步骤摘要】
检测FGD1基因突变的引物和方法
本专利技术属生命科学和生物
,特别涉及检测FGD1659+27T>C和482-113C>T位点突变的引物,采用普通PCR结合Sanger测序技术,可用于快速检测FGD1位点的突变情况。
技术介绍
Aarskog综合征(AarskogSyndrome,AAS)是一种罕见的遗传性面-指-生殖器异常综合征,主要临床表现为身材矮小、面部、指(趾)和生殖器形态改变,但程度各异,还可合并其他多种异常,目前诊断必备的表型尚不明确。AAS是由位于Xp11.21的FGD1基因突变所致的一种X连锁隐性遗传性疾病。FGD1基因(FYVE,RhoGEFandPHdomaincontainingl,NC_000023)共含有18个外显子,能够编码形成一种鸟嘌呤核苷酸转化因子(guaninenucleotideexchangefactor,GEF)。目前已经发现有多种FGD1的突变可导致AAS的发生,包括第4,6,9-12及17号外显子区的缺失突变,第3和7号外显子区的插入突变,第3-8及15号外显子区的错义突变,以及在7、8、11号内含子剪切位点上的突变等。FGD1基因的突变可导致其编码的GEF的结构域发生空间结构改变,从而干扰了FGD1/Cdc42正常的信号传递系统,导致AAS的发生。AAS患者可出现身材矮小、智力缺陷及生育障碍等多种复杂、严重的临床症状,严重威胁着患者的身体健康和生活质量。通过检测FGD1基因突变情况,将有望据此对高危的可疑人群(如有相关家族史,或有放射性辐射接触史等)开展早期筛查和干预,从而将有利于对该病进行基因筛查、产前诊断、植入前遗传学分析、靶位治疗和新药研发等,最终对该病的早期预防与诊断、优生与优育等产生重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测FGD1659+27T>C和482-113C>T位点突变的引物,采用PCR结合Sanger测序技术,可用于快速检测FGD1659+27T>C和482-113C>T位点的突变情况。所述检测FGD1659+27T>C和482-113C>T位点突变情况的引物,包括:扩增FGD1659+27T>C和482-113C>T位点5号外显子的引物,其碱基序列为:FGD1-EXON-3-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCCTGAGTTCAAGCAATFGD1-EXON-3-R:AACAGCTATGACCATGTCTGAGGTGGGTGGTGGAC。进一步地,还包括测序引物,其碱基序列为:M13F:TGTAAAACGACGGCCAGTM13R:AACAGCTATGACCATG本专利技术提供了检测FGD1659+27T>C和482-113C>T位点突变情况的方法,包括以下步骤:(1)抽提血液中的基因组DNA;(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA;(3)对步骤2中的扩增产物进行测序;(4)对测序结果进行判断,确定FGD1659+27T>C和482-113C>T位点是否发生突变。本专利技术还提供了一种检测FGD1659+27T>C和482-113C>T位点突变的试剂盒,包括(i)血液DNA抽提试剂;(ii)检测体系PCR扩增反应液;(iii)测序体系试剂。本专利技术还提供了一种检测FGD1659+27T>C和482-113C>T位点突变的试剂盒,所述试剂盒包括检测体系PCR扩增反应液、测序体系反应液,所述检测体系PCR扩增反应液包括至少FGD1-EXON-3-F和FGD1-EXON-3-R这对扩增引物,所述测序体系反应液包括M13F和M13R这对测序引物。进一步地,所述检测体系PCR扩增反应液还包括2×PCRBuffer、dNTPs和KODFXDNAPolymerase。进一步地,所述测序体系反应液还包括EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI和BigdyeTerminatorV3.1。有益效果:本专利技术设计了扩增FGD1659+27T>C和482-113C>T位点的引物。采用PCR技术,构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件,可使扩增效率达到最佳。本专利技术利用Sanger测序技术检测FGD1659+27T>C和482-113C>T位点突变的方法,可以准确将FGD1659+27T>C和482-113C>T位点突变类型检测出来,相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计2个探针,而且不能在同一管里检测,成本高,检测难度大。附图说明图1为20例临床样本引物扩增后的琼脂糖凝胶电泳图,M为MarkerDL2000,1-20为20例血液样本,经验证,引物扩增有效,且目的条带清晰,产物大小正确。图2为样本3FGD1659+27T位点的测序截图,表明为阴性样本。图3为样本1FGD1659+27T位点的测序截图,表明为阳性样本。图4为样本3FGD1482-113C位点的测序截图,表明为阴性样本。图5为样本1FGD1482-113C位点的测序截图,表明为阳性样本。具体实施方式实施例1下面结合具体实施例和附图,进一步阐述本专利技术。应当注意的是,实施例中未说明的常规条件和方法,通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如,奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版,或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。一种检测FGD1659+27T>C和482-113C>T位点突变的引物和方法,该引物是针对扩增FGD1659+27T>C和482-113C>T位点突变所设计的特异性扩增引物,其碱基序列为:FGD1-EXON-3-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCCTGAGTTCAAGCAATFGD1-EXON-3-R:AACAGCTATGACCATGTCTGAGGTGGGTGGTGGAC。一种检测FGD1659+27T>C和482-113C>T位点突变的试剂盒,包括(i)血液DNA抽提试剂;(ii)检测体系PCR反应液;(iii)测序体系试剂;(iv)阳性对照品和阴性对照品。其中,血液DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。检测体系PCR扩增反应液包括:2×PCRBuffer;2mMdNTPs;KODFXDNAPolymerase(1U/μl);FGD1659+27T>C和482-113C>T位点上、下游引物(10μM)。测序体系试剂包括:测序纯化液(ExoI:0.6U,CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75%乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物:M13F和M13R(3.2μM)。实施例2血液基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程:(1)抽提血液中的基因组DNA1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液,颠倒混匀,室温放置5分钟,期间再颠倒混匀几次。12,000rpm离心1min,吸去上清,留下白细胞沉淀,加200μl缓冲液GA,振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液,混匀。3)加入200μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.检测FGD1 659+27T>C和482‑113C>T位点突变情况的引物,其特征在于,包括扩增FGD1 659+27T>C和482‑113C>T位点的引物,其碱基序列为:FGD1‑EXON‑3‑F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCCTGAGTTCAAGCAATFGD1‑EXON‑3‑R:AACAGCTATGACCATGTCTGAGGTGGGTGGTGGAC。

【技术特征摘要】
1.检测FGD1659+27T>C和482-113C>T位点突变情况的引物,其特征在于,包括扩增FGD1659+27T>C和482-113C>T位点的引物,其碱基序列为:FGD1-EXON-3-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCCTGAGTTCAAGCAATFGD1-EXON-3-R:AACAGCTATGACCATGTCTGAGGTGGGTGGTGGAC。2.如权利要求1所述的引物,其特征在于,还包括测序引物,其碱基序列为:M13F:TGTAAAACGACGGCCAGTM13R:AACAGCTATGACCATG。3.检测FGD1659+27T>C和482-113C>T位点突变情况的方法,包括以下步骤:(1)抽提血液中的...

【专利技术属性】
技术研发人员:牛林梅吴鹏飞王淑一
申请(专利权)人:杭州艾迪康医学检验中心有限公司
类型:发明
国别省市:浙江,33

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