miR-99a在激素性股骨头坏死中的应用制造技术

miR‑99a在激素性股骨头坏死中的应用。本发明专利技术公开了miR‑99a作为标志物在制备检测激素性股骨头坏死的产品中的应用。本发明专利技术还提供了miR‑99a抑制剂在制备治疗激素性股骨头坏死的药物中的应用；所述药物包含miR‑99a的抑制剂作为活性成分。本发明专利技术发现miR‑99a特异性强，灵敏度高，能够有效地用于早期检测激素性股骨头坏死，并且可用于基因治疗、药物治疗等临床应用。

【技术实现步骤摘要】
miR-99a在激素性股骨头坏死中的应用
本专利技术涉及生物分子学及医学领域，具体涉及利用miR-99a在激素性股骨头坏死中的应用。
技术介绍
股骨头坏死(osteonecrosisoffemoralhead，ONFH)因其主要病理系股骨头血运受阻，遭受破坏而引起的头部骨质缺血，故多称为股骨头缺血性坏死(avascμLarnecrosis，AVN)，是一种好发于中青年人群的骨科常见且难治性疾病，致残率极高。在我国，每年需要治疗的ONFH患者数为500～750万，每年新发患者数为15～20万，患者多为37-45岁的青壮年，男性发病例数多于女性，我国男女发病比例为3.8:1。其中激素性股骨头坏死(steroid-inducedavascμLarnecrosisofthefemoralhead，SANFH)占非创伤性股骨头坏死的66.7％。类糖皮质激素能够通过抑制成骨细胞的分化及活性，促进成骨细胞和骨细胞凋亡，抑制骨形成；另一方面，促进破骨细胞的分化及活性，延长其生存周期，加强对骨质的吸收，从而使骨形成与骨吸收偶联机制失去平衡，导致SANFH。该病初发时并无明显临床表现，随着病情加重，最终导致髋关节坏死和塌陷。目前，针对于SANFH的现有临床治疗方案收效甚微，这很大程度上归因于SANFH机制不明且诊断方法滞后。因此，探索SANFH的发病机制，了解及掌握更新、更有效的早期诊断及临床治疗方法，具有重要意义。SANFH的研究一直是骨科研究中的热点，因其病因复杂，有关SANFH发病机制的假说也有很多种，如凝血功能紊乱学说、脂质代谢学说、股骨头内高压学说、血管内皮损伤学说、骨髓间充质干细胞功能紊乱学说等等，虽然这些研究有一些临床和实验研究依据，但均不能完全解释股骨头坏死的全部病理过程。因此，探索SANFH的发病机制，寻找相关的miRNA成为现代研究的重点和热点。MicroRNA(miRNAs)是一类长约22～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子，可通过碱基互补配对的方式结合靶基因的3’非编码区(3’TTR)，从而抑制翻译或降解靶基因。MicroRNA在进化过程中高度保守，在生物体内分布广泛，并参与许多复杂的生物学过程，如胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢、骨形成等。有研究表明：miRNAs通过调控成骨分化相关基因表达在骨形成中起关键作用，如miR-216促进人脂肪组织来源的间充质干细胞向成骨分化、miR-494通过调节Runx2的表达抑制成骨细胞分化等。因此本领域迫切需要开展与激素性股骨头坏死相关联的特异性miRNA作为早期诊断的标记物的研究，以便提供新的有效的预防和治疗靶点。早期的诊断和治疗是治疗SANFH的关键。随着生物信息学的不断发展，越来越多的和SANFH相关的基因见诸报道，证实了多种基因在ANFH的发生发展中的作用，为SANFH的早期诊断和治疗提供了理论依据。
技术实现思路
为了实现激素性股骨头坏死的早期诊断及早期治疗，本专利技术的目的在于提供一种新的与激素性股骨头坏死的标志物miR-99a，并提供其在制备激素性股骨头坏死的检测产品以及治疗药物中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：首先，本专利技术提供了miR-99a作为标志物在制备检测激素性股骨头坏死的产品中的应用。优选的，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。优选的，所述miR-99a在检测激素性股骨头坏死患者的样本中表达水平上调。进一步地，本专利技术提供了miR-99a抑制剂在制备治疗激素性股骨头坏死的药物中的应用。优选的，所述药物包含miR-99a的抑制剂作为活性成分。优选的，所述miR-99a抑制剂能够抑制miR-99a的功能。优选的，所述miR-99a抑制剂选自：能降低miR-99a表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸；或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。优选的，所述miR-99a的反义寡核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。优选地，所述miR-99a的反义寡核苷酸序列是根据miR-99a序列设计出它的特异性反义寡核苷酸，将反义寡核苷酸转移到细胞内，它们能够明显抑制miR-99a的转录水平。在本专利技术中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，优选地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(lockednucleicacid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来的修饰技术。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性、抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本专利技术中。更进一步地，本专利技术提供了miR-99a抑制剂在促进骨分化产品中的应用。优选的，miR-99a抑制剂能促进成骨分化标志物的表达。优选的，所述成骨标志物包括ALP(碱性磷酸酶)、OPN(骨桥蛋白)、RUNX2(runt相关转录因子2)。其中，ALP和OPN被认为是成骨分化的早期标志物；RUNX2被认为在成骨细胞分化过程中起关键作用，是成骨细胞分化的标志性转录因子，该基因的异常表达将导致骨发育不良或骨形成障碍。有益效果本专利技术公开了一种与激素性股骨头坏死相关的miR-99a，并进一步证实miR-99a在激素性股骨头坏死的样本中表达上调。进一步，本专利技术公开miR-99a抑制剂，以及在制备治疗激素性股骨头坏死的药物中的应用。利用miR-99a检测激素性股骨头坏死不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。附图说明图1miR-99a在激素性股骨头坏死患者表达水平；图2miR-99a低表达后对BMSC成骨分化标志物表达的影响。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是骨髓中一类具有多向分化潜能的细胞，可以分化为成骨细胞、成纤维细胞、网状细胞等，并在多种疾病发生发展过程中起到非常重要作用。本专利技术通过在细胞水平通过现代分子生物学技术研究miRNA与SANFH病变的关系。本研究将有助于揭示SANFH发病机制，具有理论和临床价值。本专利技术的实施可能为SANFH的早期诊断及预防提供新思路，为SANFH的治疗提供新的药物靶点，使广大SANFH患者免受手术之苦。本专利技术所述miR-99a选自以下组：初始miR-99a、前体miR-99a、成熟miR-99a；初始miR-99a能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；前体miR-99a能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；所述成熟miRNA为miR-99a-5p。所述miR-99a的核苷酸序列为SEQIDNo:4，所述miR-99a-5p的核苷酸序列为SEQIDNo:5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.miR‑99a作为标志物在制备检测激素性股骨头坏死的产品中的应用。

【技术特征摘要】
1.miR-99a作为标志物在制备检测激素性股骨头坏死的产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述miR-99a在检测激素性股骨头坏死患者的样本中表达水平上调。4.miR-99a抑制剂在制备治疗激素性股骨头坏死的药物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物包含miR-99a的抑制剂作为活性成分。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述miR-99a抑制剂能够抑制miR-99a的功能。7.根据权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁习生，项永波，边焱焱，李曾，程开源，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：北京,11