一种检测Y染色体拷贝数变异的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及遗传病基因检测领域，具体涉及一种检测Y染色体拷贝数变异的方法和试剂盒。该方法具体包括：获取样本，并从所述样本中提取基因组DNA；将所述基因组DNA中Y染色体特异性基因和任意一条常染色体的内参基因进行定量实时扩增；获取并比较扩增过程相同循环下的所述特异性基因和内参基因荧光增加值，与预设的标准品荧光值进行对比，获得Y染色体拷贝数。本发明专利技术采用的荧光PCR法相对定量通常采用比较Ct法，本发明专利技术结合荧光比值算法和标准品设置，无需靶基因和内参基因扩增效率相等，且检测更加准确、灵敏，能够快速准确的获得Y染色体上拷贝数，确定Y染色体拷贝数的变异情况。

【技术实现步骤摘要】
一种检测Y染色体拷贝数变异的方法和试剂盒
本专利技术涉及遗传病基因检测领域，具体涉及一种检测Y染色体拷贝数变异的方法和试剂盒。
技术介绍
拷贝数变异(copynumbervariation,CNV)是指与参考序列相比，发生在基因组上的长度大于1kb的DNA片段由于重复、缺失等原因造成的微结构变异，是人类疾病的重要致病因素之一。目前对CNV进行检测的方法很多，包括基于芯片的比较基因组杂交(array-basedcomparativegenomichybridization，aCGH)、单核苷酸多态性-微阵列(SNP-array)、基于二代测序的CNV分析、多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)等。这些技术检测位点多、准确性高、部分方法检测分辨率达到1bp。但是上述测试方法的检测周期长，检测成本高，无法满足现有技术对拷贝数变异检测的需求。
技术实现思路
针对现有技术中存在不足，本专利技术所提供的技术方案是：一种检测Y染色体拷贝数的方法包括以下步骤：获取样本，并从所述样本中提取基因组DNA；将所述基因组DNA中Y染色体特异性基因SRY和任意一条常染色体的内参基因进行定量实时扩增；获取并比较扩增过程相同循环下的所述特异性基因SRY和内参基因荧光增加值，与预设的标准品荧光值进行对比，获得Y染色体拷贝数。一种检测Y染色体拷贝数变异的试剂盒，具体包括：引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、探针Ⅰ、探针Ⅱ、TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs、ROX荧光PCR参比染料和基因组DNA。有益效果：本专利技术通过将Y染色体上的特异性基因和任意一条常染色体进行定量实时扩增，获得两种基因的荧光增加值，通过将两者该荧光增加值的比值与标准品进行对比获得Y染色体拷贝数变异情况。本专利技术无需靶基因和内参基因扩增效率一致，实验流程简单，检验结果更接近真实值。特别的，本专利技术设置标准品，使得拷贝数定量更加准确可靠。还公开了一种检测Y染色体拷贝数变异的试剂盒，利用本专利技术提供的方法和试剂盒，能够快速准确的获得Y染色体上拷贝数，确定Y染色体拷贝数的变异情况。附图说明附图1为不同比例标准品的荧光比值柱状图；附图2为18例正常男性和4例超雄症患者的拷贝数检测荧光比值柱状图；附图3为样本A2拷贝数检测Rsry/rabif比值柱状图。具体实施方式为了更加清楚阐述本专利技术的
技术实现思路
，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的
技术实现思路
显而易见地得出的其他技术方案仍属于本专利技术的保护范围。名词解释：SRY(sex-determiningregionofY-chromosome)基因：Y染色体性别决定区，是人体Y染色体断臂末端上的一段基因片段，该基因是决定男性睾丸发育的主要基因，通常用作检测Y染色体存在的特异性基因序列。RABIF(RABinteractingfacor)基因：RAB作用因子，用于编码Mss4鸟苷酸交换因子，由于序列保守且特异，发生拷贝数变异频率低，通常用作对照基因。本申请实施例以RABIF基因作为内参基因，应当理解的是，凡是处于常染色体上的基因，且序列保守且具有一定的特异性，发生拷贝数变异频率低的基因均可以作为检测Y染色体拷贝数变异基因的内参基因。实施例1标准品的制备：在铂尚生物合成RABIF和SRY基因片段，且RABIF和SRY基因片段的3’端携带突出碱基“A”，同时质粒pUC57(大肠杆菌克隆质粒)5’端携带突出碱基“T”，采用连接酶将RABIF和SRY基因片段分别连接至质粒pUC57，获得重组质粒ⅠpUC-SRY和重组质粒ⅡpUC-RABIF。用TE缓冲液将重组质粒ⅠpUC-SRY和重组质粒ⅡpUC-RABIF稀释至相同摩尔浓度，并配置成摩尔比为1:2、2:2、3:2、4:2、5:2的标准品。实施例2本专利技术通过引物设计原则和多种计算机程序，设计获得Y染色体特异性基因SRY和1号染色体内参基因RABIF的PCR引物组和探针，并通过大量实验筛选出特异性高的引物序列，具体如比1所示。表1其中Y染色体特异SRY探针的5’端和3’端分别用ROX荧光基团和BHQ2淬灭基团进行修饰，获得的Y染色体特异SRY探针为ROX-TCAGTGTGAAACGGGAGAAAACA-BHQ2；其中1号染色体内参基因RABIF探针的5’端和3’端分别用6-FAM荧光基团和BHQ1淬灭基团进行修饰，获得的1号染色体内参基因RABIF探针为6FAM-AAAGGCCAGTTCTTGTGGGG-BHQ1。实施例3本实施例具体公开了标准品荧光增加值的检测，包括具体包括：标准品定量实时PCR(qPCR)反应体系的配制：GoldStarTaqDNA聚合酶0.16uL，5×GoldStarPCR缓冲液4ul，dNTP混合物(10mMeach)0.4ul，氯化镁(100mM)0.4ul，RABIF引物1(10mM)0.4ul，RABIF引物2(10mM)0.4ul，RABIF探针(10mM)0.16ul，SRY引物1(10mM)0.4ul，SRY引物2(10mM)0.4ul，SRY探针(10mM)0.16ul，ROX荧光PCR参比染料0.4ul，标准品3ul，加水补齐至20ul。qPCR排版为：以上述5种标准品为模板的样本检测，同时设置水作为模板的NTC检测，样品检测和NTC(Notemplatecontrol，空白对照组)均设置4个复孔。将上述标准品的qPCR体系至于95℃处理10min，40个循环(95℃15sec，60℃1min收集信号)。本专利技术按照以下荧光比值法进行计算：获取qPCR原始荧光值数据“rawdata”。选定计算baseline荧光值的起始循环数和终止循环数，计算起始和终止之间所有循环的平均荧光值作为baseline荧光值，例如起始循环为3，终止循环为15，则计算3-15循环(共计13个循环)的荧光值的平均值作为baseline荧光值。根据qPCR曲线(log曲线更优)选定某一循环数，使得RABIF和SRY都处于对数期。Rsry/rabif等于第n循环SRY荧光增加值除以RABIF荧光增加值，其中荧光增加值等于第n个循环荧光值减去baseline荧光值。计算4个复孔荧光增加值的平均值作为Rsry/rabif平均值，荧光增加值的标准方差作为Rsry/rabif误差。5种标准比例模板的SRY和RABIF荧光比值结果如附图1所示：荧光比值和Y染色体拷贝数呈现对应关系，随着SRY比例的提高荧光比值随之升高，本专利所述方法明显区分1:2、2:2、3:2这些常规qPCR计算方法难以分辨的拷贝数差异。两种标准品荧光比值的误差值不交叉，计算值准确。实施例4本实施例提供了18例正常男性和4例超雄性患者Y染色体拷贝数的检测方法，以验证该方法的准确性，具体包括以下步骤：基因组DNA提取：本实施例以从血液中提取基因组DNA为例，本血液抽提试剂盒购自天根生化科技有限公司，具体步骤如下：取200μL血液样本到2.0mL的离心管中。若提取小于200μL血液样品时，可加入缓冲液GS补足体积至200μL，再进行下一步实验。加入200μLBufferGB和20μL蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测Y染色体拷贝数变异的方法，其特征在于，所述检测Y染色体拷贝数的方法包括以下步骤：获取样本，并从所述样本中提取基因组DNA；将所述基因组DNA中Y染色体特异性基因SRY和任意一条常染色体的内参基因进行定量实时扩增；获取并比较扩增过程相同循环下的所述特异性基因SRY和内参基因荧光增加值，与预设的标准品荧光值进行对比，获得Y染色体拷贝数。

【技术特征摘要】
1.一种检测Y染色体拷贝数变异的方法，其特征在于，所述检测Y染色体拷贝数的方法包括以下步骤：获取样本，并从所述样本中提取基因组DNA；将所述基因组DNA中Y染色体特异性基因SRY和任意一条常染色体的内参基因进行定量实时扩增；获取并比较扩增过程相同循环下的所述特异性基因SRY和内参基因荧光增加值，与预设的标准品荧光值进行对比，获得Y染色体拷贝数。2.根据权利要求1所述的检测Y染色体拷贝数变异的方法，其特征在于，所述预设的标准品包括含有所述Y染色体特异性基因SRY的重组质粒Ⅰ和含有所述内参基因的重组质粒Ⅱ。3.根据权利要求1所述的检测Y染色体拷贝数变异的方法，其特征在于，所述常染色体的内参基因为1号染色体内参基因RABIF。4.一种检测Y染色体拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，具体包括：引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、探针Ⅰ、探针Ⅱ、TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs、ROX荧光PCR参比染料和基因组DNA。5.根据权利要求4所述的检测Y染色体拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈苗苗，杨继伟，罗俊峰，陈云弟，
申请(专利权)人：阅尔基因技术苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32