一种用于高通量测序检测基因突变的捕获探针及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因检测技术领域，具体涉及一种用于高通量测序检测基因突变的捕获探针及其应用。本发明专利技术提供一种用于高通量测序检测基因突变的捕获探针，其为单链探针混合物，包括从待测DNA的一端开始，分别针对待测DNA的正义链和反义链的核苷酸序列，依次设计的针对正义链的探针和针对反义链的探针；每两个相邻的单链探针中，一个为针对正义链的核苷酸序列设计的单链探针，另一个为针对反义链的核苷酸序列设计的单链探针；每两个相邻的单链探针所针对的待测DNA没有重叠；单链探针混合物能够覆盖全部待测DNA。本发明专利技术提供的捕获探针能够显著提高捕获文库的库容、捕获效率和测序数据有效深度，降低测序数据的重复率，具有很高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种用于高通量测序检测基因突变的捕获探针及其应用
本专利技术涉及基因检测
，具体涉及一种用于高通量测序检测基因突变的捕获探针及其应用。
技术介绍
全基因组测序可以获得全基因组水平范围的突变、插入、缺失以及结构变异。然而，由于基因组容量较大，以30×进行测序就会产生接近100G的数据量。而肿瘤等相关的低突变频率测序则需要至少1000×的覆盖度，如果进行全基因组测序，则会产生多达3000G的数据量。这样规模的数据量除了会对数据的分析工作造成极大的困难之外，还会产生巨大的测序成本。目标区域液相杂交捕获技术是根据DNA序列互补原理，设计与目标序列互补的特异性探针，并合成在固相或液相芯片上，打断样品基因组DNA，加上测序接头后与探针杂交，最终将目标区域捕获下来，后续经过回收、构建文库并直接用于高通量测序。目前国内外提供液相杂交捕获技术的公司有很多，如安捷伦、罗氏、IDT、TWISTbioscience等国外试剂厂商以及艾吉泰康、迈基诺等国内厂商。上述厂商的应用于杂交捕获的最关键的探针各有不同，也各有特色。比如：安捷伦和艾吉泰康使用是RNA探针，罗氏和IDT采用的是DNA单链探针。RNA探针和DNA单链探针设计的原则基本上是基于叠瓦式的设计方式，保持与参考基因组正义链一致或者相反，只能捕获到与参考基因组的正义链或者反义链一致的文库部分，另一条链则被丢弃，此种情况下，如果捕获效果不好，则会导致文库的两条链全部丢失，降低了文库的丰富度。TWISTbioscience、迈基诺采用双链探针进行文库捕获，这样能保证文库的两条链都被捕获，但是由于双链探针是反向互补结构，会有很多探针之间互相进行杂交，导致需要探针的用量较大或者导致捕获效率偏低。因此，开发捕获效率高、能够避免探针之间的相互作用，且能够提高文库丰富度的捕获探针具有重要意义。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的是提供一种用于高通量测序检测基因突变的捕获探针及其应用。为解决现有技术中的单链捕获探针和双链捕获探针存在的技术问题，即：(1)单链探针只能捕获目的片段的一条链，导致捕获的模板少，由于探针只有针对反义链的探针，只有片段1和片段2的两条反义链可以被捕获，而两条正义链由于与探针序列相同无法被捕获而丢失(如图1所示)。(2)双链探针虽然能够捕获目的片段1和片段2的正义链和反义链(如图2所示)，但由于双链探针是反向互补结构，会有很多探针之间互相进行杂交，导致需要探针的用量较大或者导致捕获效率偏低。本专利技术创造性地提出一种全新的捕获探针设计方法，本专利技术采用针对正义链的单链探针和针对反义链的单链探针交错排列、覆盖全部目的区域的形式，既避免了探针之间的互相杂交，导致捕获效率以及探针利用率降低，又能同时捕获文库中目的片段的两条链，提高文库总量和丰富度，本专利技术的探针设计示意图如图3所示。首先，本专利技术提供一种用于高通量测序检测基因突变的捕获探针，所述捕获探针为单链探针混合物，所述单链探针混合物包括从待测DNA的一端开始，分别针对待测DNA的正义链和反义链的核苷酸序列，依次设计的针对正义链的探针和针对反义链的探针；每两个相邻的单链探针中，一个为针对正义链的核苷酸序列设计的单链探针，另一个为针对反义链的核苷酸序列设计的单链探针；每两个相邻的单链探针所针对的待测DNA没有重叠；所述单链探针混合物能够覆盖全部待测DNA。合适的探针长度和混合比例能够更好地提高探针捕获效率，本专利技术中，所述单链探针的长度为90～120nt；所述单链探针混合物中每个单链探针以相同的摩尔比例混合。优选地，本专利技术中，所述单链探针的长度为110～120nt。在此基础上，本专利技术还提供所述捕获探针在基因组测序文库构建或高通量测序检测基因突变中的应用。本专利技术还提供一种基因突变测序文库的构建方法，其为将基因组DNA打断，采用本专利技术所述的捕获探针构建测序文库。具体地，基因突变测序文库的构建方法包括如下步骤：(1)提取基因组DNA，将其打断为小片段；(2)对步骤(1)得到的小片段DNA进行文库制备；(3)将步骤(2)得到的小片段DNA文库与本专利技术所述的捕获探针进行杂交，捕获目的片段；(4)对步骤(3)捕获的片段进行扩增，将扩增产物上机测序。在上述捕获探针及其制备方法的指导下，本专利技术以EGFR基因突变检测为例，开发针对EGFR基因的捕获探针。本专利技术提供一种EGFR基因的特异性捕获探针，其包括如SEQIDNO.172～SEQIDNO.228所示的单链探针。本专利技术中，所述捕获探针可以采用任意本领域允许的生物标记物进行标记，作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术采用生物素标记上述单链探针。在上述捕获探针的基础上，本专利技术提供一种检测EGFR基因突变的试剂盒，其包括所述EGFR基因的特异性捕获探针。优选地，所述捕获探针由如SEQIDNO.172～SEQIDNO.228所示的单链探针等摩尔比例混合组成。更优选地，所述捕获探针的工作浓度为0.1pM～0.75pM。为便于实现EGFR基因突变的高通量测序，本专利技术中，所述试剂盒还包括杂交缓冲液、洗脱缓冲液、阳性质控品、阴性质控品。进一步地，本专利技术还提供所述EGFR基因的特异性捕获探针或包含EGFR基因的特异性捕获探针的试剂盒在高通量测序检测EGFR基因突变或构建检测EGFR基因突变的测序文库中的应用。作为本专利技术的一种实施方式，利用本专利技术所述的捕获探针进行测序文库的构建和高通量测序的方法包括如下步骤：(1)探针设计、合成与标记；(2)捕获前文库构建：将基因组DNA打断为小片段，进行测序文库构建；(3)步骤(2)构建的文库与捕获探针杂交，进行捕获文库的构建；(4)上机测序和数据分析。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种全新的捕获探针制备方法，将针对正义链的探针和针对反义链的探针交错分布、覆盖全部目的区域，既避免了由于探针之间的互相杂交导致的捕获效率及探针利用率降低，又能同时捕获文库中目的片段的两条链，提高文库总量和丰富度，能够同时保证捕获文库的丰富度和捕获效率。采用本专利技术提供的捕获探针设计方法制备的EGFR特异性捕获探针，在进行测序文库构建和高通量测序时，能够同时实现文库库容大、捕获效率高、数据重复率低和数据有效深度高的技术效果，有利于提高高通量测序的工作效率，具有很高的应用价值。附图说明图1为本专利技术
技术实现思路
中传统单链探针的设计示意图。图2为本专利技术
技术实现思路
中传统双链探针的设计示意图。图3为本专利技术
技术实现思路
中针对正义链和反义链的单链探针交错分布的探针设计示意图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1本实施例以表皮生长因子受体EGFR为例，验证本专利技术提供的捕获探针的设计方法。针对EGFR全外显子区域分布设计三种形式的探针：传统的单链探针(对照组1)、双链探针(对照组2)以及本专利技术提供的正义链探针和反义链探针交错排列的单链探针(实验组)，并进行人类基因组文库构建本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于高通量测序检测基因突变的捕获探针，其特征在于，所述捕获探针为单链探针混合物，所述单链探针混合物包括从待测DNA的一端开始，分别针对待测DNA的正义链和反义链的核苷酸序列，依次设计的针对正义链的探针和针对反义链的探针；每两个相邻的单链探针中，一个为针对正义链的核苷酸序列设计的单链探针，另一个为针对反义链的核苷酸序列设计的单链探针；每两个相邻的单链探针所针对的待测DNA没有重叠；所述单链探针混合物能够覆盖全部待测DNA。

【技术特征摘要】
1.一种用于高通量测序检测基因突变的捕获探针，其特征在于，所述捕获探针为单链探针混合物，所述单链探针混合物包括从待测DNA的一端开始，分别针对待测DNA的正义链和反义链的核苷酸序列，依次设计的针对正义链的探针和针对反义链的探针；每两个相邻的单链探针中，一个为针对正义链的核苷酸序列设计的单链探针，另一个为针对反义链的核苷酸序列设计的单链探针；每两个相邻的单链探针所针对的待测DNA没有重叠；所述单链探针混合物能够覆盖全部待测DNA。2.根据权利要求1所述的捕获探针，其特征在于，所述单链探针的长度为90～120nt；所述单链探针混合物中每个单链探针以相同的摩尔比例混合；优选地，所述单链探针的长度为110～120nt。3.权利要求1或2所述的捕获探针在基因组测序文库构建或高通量测序检测基因突变中的应用。4.一种基因突变测序文库的构建方法，其特征在于，将基因组DNA打断，采用权利要求1或2所述的捕获探针构建测序文库。5.根据权利要求4所述的构建方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：方楠，刘运超，李伟伟，王建伟，伍启熹，刘倩，刘珂弟，唐宇，
申请(专利权)人：北京优迅医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11