基于自催化复制介导的循环信号放大检测人8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的方法技术

本发明专利技术公开了基于自催化复制介导的循环信号放大检测人8‑羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的方法，采用的生物传感器包括发夹底物、MB1、MB2、Fok I和APE1，发夹底物的有义链或反义链中设计受损的鸟嘌呤和回文序列，受损的鸟嘌呤位于回文序列与环之间，另一条链设计与受损的鸟嘌呤匹配的胞嘧啶；MB1为5'端凸出的茎环结构，MB1的环设计回文序列，MB1凸出的5'‑末端DNA序列上设计与发夹底物的环互补的序列，MB1、MB2均修饰荧光分子和淬灭分子。本发明专利技术能够简便、高灵敏、高特异的检测hOGG1。

【技术实现步骤摘要】
基于自催化复制介导的循环信号放大检测人8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的方法
本专利技术涉及生物分析技术，具体涉及基于自催化复制介导的循环信号放大检测人8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的方法。
技术介绍
这里的陈述仅提供与本专利技术有关的背景信息，而不必然构成现有技术。基因组DNA由Watson-Crick配对的杂环碱基组成(即A与T和G与C)，是遗传信息的主要载体，负责将遗传密码翻译成多功能蛋白质。基因组DNA准确性和完整性的维持是所有生物体生存的基本先决条件。然而，在现实生活中，基因组DNA经常受到来自于各种外源和内源因素的破坏，导致每天每个细胞存在至少104种损伤(如碱基氧化、DNA烷基化、DNA脱氨、DNA加合物和DNA链断裂)，从而造成基因组的不稳定，进而引发癌变。8-氧代-7，8-二氢鸟嘌呤(8-oxoG，受损的鸟嘌呤)是最常见的DNA损伤形式之一，其是由2’-脱氧鸟苷(dG)氧化产生的。8-OxoG可模拟2’-脱氧胸苷(dT)，与2’-脱氧腺苷(dA)发生错配，从而在DNA复制时诱导G：C向T:A的转化，引发永久性DNA突变。为修复8-oxoG，人类细胞进化出一种非常重要的细胞保护机制，即碱基切除修复(BER)，来应对DNA的氧化损伤。人类8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)是一种高度保守和广泛分布的DNA糖基化酶，它负责启动BER途径的最关键的第一步。hOGG1可以特异性地从8-oxoG：C配对中去除8-oxoG，然后与其他修复酶配合恢复原始G：C碱基对。hOGG1活性的失调会导致BER功能障碍，最终引发各种疾病，包括帕金森病(PD)、自身免疫性炎症、肺癌、乳腺癌、胆囊癌、胃癌、膀胱癌、口咽癌等。因此，作为一种重要的生物标志物和潜在的治疗靶标，准确、敏感地检测hOGG1对DNA氧化损伤修复研究和临床诊断都具有重要的意义。到目前为止，已经开发了多种用于监测hOGG1活性的方法。原则上，hOGG1活性的定量用两种模式：一种是通过测量释放的受损碱基(即8-oxoG)的量，另一种是通过测定含有AP位点链的量来实现。在前一种模式中，用于hOGG1测定的常规方法包括高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。然而，HPLC和MS通常会受到样品收集和制备过程中产生的人为8-oxoG的困扰，其会反过来导致背景信号的增强。而ELISA会因为多步的洗涤步骤而低估实际的8-oxoG含量。此外，HPLC，MS和ELISA都不可避免地需要耗时耗力的操作，以及复杂的仪器，昂贵的抗体或严苛的反应条件。为了克服以上困难，另一种模式被开发了出来。凝胶电泳结合底物的P-放射性标记是公认的标准方法，但它存在放射性污染、灵敏度差和耗时长等缺点。比色法利用DNA-金纳米粒子(AuNP)探针末端共价捕获目标酶来阻止核酸外切酶的降解，从而实现对hOGG1活性的可视化检测，但是AuNPs的合成和DNA-AuNP探针的制备往往费时费力。基于切除修复诱导的量子点(QD)自组装荧光检测法，通过荧光共振能量转移(FRET)技术实现了对hOGG1活性的检测；通过两个响应切除修复的分子信标，基于全内反射荧光(TIRF)成像，可实现对hOGG1和人烷基腺嘌呤DNA糖化酶(hAAG)活性的同时定量。但是以上方法涉及到昂贵的荧光纳米材料(QD)、精密的仪器(即全内反射荧光显微镜(TIRFM))和复杂的操作(即基于TIRF的单分子成像)，大大限制了它们的广泛应用。此外，外切酶Ⅲ诱导的循环信号扩增和lambda外切酶辅助的再循环信号放大技术被用来对hOGG1和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)的活性进行荧光的测定，虽然检测灵敏度得到提高，但是它们都遭受到由外切核酸酶的非特异性切割引发的高背景信号。因此，开发能够简便、高灵敏、高特异的检测hOGG1的荧光方法仍然是非常必要的。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术的一方面是提供一种检测8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶生物传感器，该传感器能够简便、高灵敏、高特异的检测hOGG1。本专利技术的技术方案为：一种检测人8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶生物传感器，包括发夹底物、第一信号探针(MB1)、第二信号探针(MB2)、FokI和人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)，所述发夹底物为茎环结构，发夹底物的茎含有互补的有义链和反义链，有义链或反义链中设计受损的鸟嘌呤和能够被FokI识别的回文序列，受损的鸟嘌呤位于回文序列与环之间，另一条链设计与受损的鸟嘌呤匹配的胞嘧啶；所述第一信号探针为5'端凸出的茎环结构，第一信号探针的环设计能够被FokI识别的回文序列，第一信号探针凸出的5'-末端DNA序列上设计与发夹底物的环互补的序列，第一信号探针3'端修饰荧光分子，第一信号探针凸出的5'-末端DNA序列的一个碱基修饰淬灭分子；所述第二信号探针为5'端凸出的茎环结构，第二信号探针的凸出5'-末端DNA序列上设计能够被FokI识别的回文序列，第二信号探针3'端修饰荧光分子，第二信号探针凸出的5'-末端DNA序列的一个碱基修饰淬灭分子，第二信号探针的淬灭分子位于第二信号探针的回文序列与第二信号探针的环之间。对于任意输入的DNA片段，FokI可以催化预先设计的DNA发夹探针的自主切割，从而导致核酸模板的复制。在自主生物催化过程中，输入的DNA片段与预先定制的DNA发夹探针相邻杂交以产生长dsDNA结构，同时形成生物催化DNA模板(即含有FokI的识别和切割结构域的dsDNA序列)。DNA模板的形成激活FokI催化的dsDNA结构的自主切割，释放输入的DNA片段。释放的DNA片段可以引发新的杂交，切割和释放，导致DNA发夹探针的反复降解并因此导致核酸模板的持续自我复制。本专利技术利用FokI独特的催化特性，以DNA为自复制生物材料，构建了一个酶催化的核酸复制系统，基于自催化复制介导的循环信号放大，首次实现了自复制系统对蛋白质酶即人8-氧脱氧DNA糖基化酶1(hOGG1)的检测分析应用。本专利技术的另一方面提供了基于自催化复制介导的循环信号放大检测人8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的方法，提供上述生物传感器，由两个连续的反应组成：(1)hOGG1引发的发夹底物的切割：hOGG1通过切割发夹底物中，脱氧戊糖和受损碱基之间的N-糖苷键，特异性识别并切除受损的鸟嘌呤，产生脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点，然后通过APE1的辅助有效切除AP位点，产生单核苷酸间隙，从而导致发夹底物的环部展开；(2)自催化复制介导的分子信标(即MB1和MB2)级联切割引发的循环信号放大：发夹底物的环序列将与MB1凸出的5'端DNA序列杂交，产生第一双链DNA(dsDNA)结构，FokI识别第一双链DNA结构中的回文序列，并使第一双链DNA结构中的MB1分别在其5'和3'端被切割从而释放展开的发夹底物、第一切割产物及荧光分子，释放的展开发夹底物与多余的MB1进行杂交使得MB1循环切割，第一切割产物与MB2凸出的5'端DNA序列杂交，产生第二dsDNA结构，FokI识别第二双链DNA结构中的回文序列，并使第二双链DNA结构中的MB2分别在其5'和3'端被切割从而释放展开的第一切割产物、第二切割产物及荧光分子，释放的第一切割产物与多余的MB2进行杂交使得M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测人8‑羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶生物传感器，其特征是，包括发夹底物、第一信号探针、第二信号探针、Fok I和人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶，所述发夹底物为茎环结构，发夹底物的茎含有互补的有义链和反义链，有义链或反义链中设计受损的鸟嘌呤和能够被Fok I识别的回文序列，受损的鸟嘌呤位于回文序列与环之间，另一条链设计与受损的鸟嘌呤匹配的胞嘧啶；所述第一信号探针为5'端凸出的茎环结构，第一信号探针的环设计能够被Fok I识别的回文序列，第一信号探针凸出的5'‑末端DNA序列上设计与发夹底物的环互补的序列，第一信号探针3'端修饰荧光分子，第一信号探针凸出的5'‑末端DNA序列的一个碱基修饰淬灭分子；所述第二信号探针为5'端凸出的茎环结构，第二信号探针的凸出的5'‑末端DNA序列上设计能够被Fok I识别的回文序列，第二信号探针3'端修饰荧光分子，第二信号探针凸出的5'‑末端DNA序列的一个碱基修饰淬灭分子，第二信号探针的淬灭分子位于第二信号探针的回文序列与第二信号探针的环之间。

【技术特征摘要】
1.一种检测人8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶生物传感器，其特征是，包括发夹底物、第一信号探针、第二信号探针、FokI和人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶，所述发夹底物为茎环结构，发夹底物的茎含有互补的有义链和反义链，有义链或反义链中设计受损的鸟嘌呤和能够被FokI识别的回文序列，受损的鸟嘌呤位于回文序列与环之间，另一条链设计与受损的鸟嘌呤匹配的胞嘧啶；所述第一信号探针为5'端凸出的茎环结构，第一信号探针的环设计能够被FokI识别的回文序列，第一信号探针凸出的5'-末端DNA序列上设计与发夹底物的环互补的序列，第一信号探针3'端修饰荧光分子，第一信号探针凸出的5'-末端DNA序列的一个碱基修饰淬灭分子；所述第二信号探针为5'端凸出的茎环结构，第二信号探针的凸出的5'-末端DNA序列上设计能够被FokI识别的回文序列，第二信号探针3'端修饰荧光分子，第二信号探针凸出的5'-末端DNA序列的一个碱基修饰淬灭分子，第二信号探针的淬灭分子位于第二信号探针的回文序列与第二信号探针的环之间。2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是，所述回文序列为：GGATG。3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是，发夹底物中，受损的鸟嘌呤位于距环2个碱基的位点；或，发夹底物中，回文序列位于距环4个碱基的位点；或，发夹底物的环部为4个碱基的DNA序列。4.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是，第一信号探针中，距离5'-末端第7个碱基上修饰淬灭分子；或，第一信号探针中，5'-末端DNA序列的碱基数为9nt。5.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是，第二信号探针中，距离5'-末端第14个碱基上修饰淬灭分子；或，第二信号探针中，5'-末端DNA序列的碱基数为18nt。6.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是，发夹底物的序列为：5'-CTAGGATGCOGTATTTACCGCATCCTAG-3'；第一信号探针的序列为：5'-GGTAAATACGGGACTTTGTGCATCCACAAAGTCCC-3'；第二信号探针的序列为：5'-TGGATGCACAAAGTCCCGATTGTTCGATCTCTCGAACAAT-3'。7.基于自催化复制介导的循环信号放大检测8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的方法，其特征是，提供权利要求1～6任一所述的生物传感器，由两个连续的反应组成：(1)hOGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，王黎娟，王厚秀，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37