本发明专利技术公开了适用于单细胞测序的人冰冻肿瘤组织细胞核分离方法和提取细胞核的方法。该提取细胞核的方法包括：将待提取样品进行裂解处理，所述裂解处理是在第一缓冲液中进行的；将裂解产物进行第一离心处理，以便获得细胞核沉淀；将所述细胞核沉淀进行冲洗和重悬处理，冲洗和重悬处理是在第二缓冲液中进行的，以便获得所述细胞核；其中，所述第一缓冲液包括：116.8mM NaCl、pH 7.8的8mM Tris碱、0.8mM CaCl2、38mM MgCl2、0.04％BSA、0.16％Nonidet P‑40、1mM EDTA、1mg/mL DAPI；所述第二缓冲液包括：1×PBS、1.0％BSA以及0.2U/μL RNase抑制剂。该方法只需简单的试剂耗材，不需要昂贵的分离设备，便可从较少的冰冻肿瘤组织中获得足量、完整的单核用于单细胞RNA测序。
【技术实现步骤摘要】
适用于单细胞测序的人冰冻肿瘤组织细胞核分离方法
本专利技术涉及测序领域，具体地，本专利技术涉及适用于单细胞测序的人冰冻肿瘤组织细胞核分离方法。
技术介绍
单细胞测序是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组等进行高通量测序分析的新技术，用于揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，2013年被NatureMethods评为年度技术、Science列为年度最值得关注的六大领域榜首，是2017年人类细胞图谱计划应用的关键技术。单细胞测序可应用于发育生物学、免疫学、神经系统细胞、肿瘤组织等方向的研究，其中使用大规模单细胞转录组测序进行肿瘤异质性相关的研究已成为热门方向。单细胞转录组测序通过对肿瘤组织中的单个细胞的RNA进行测序，分析每个细胞中的基因表达情况，对细胞进行分类比较，研究肿瘤发生发展机制、药物作用机制等，为肿瘤分型、肿瘤治疗策略、药效预测、新药研发等提供新的方向。为了对每个细胞中的RNA进行单独标记用于数据分辨，标记完成前的细胞必须是单个悬浮且完整的活细胞，因此单细胞测序对样本要求较高，包括细胞悬浮状态、浓度、活率等。人肿瘤组织不易获得高活率单细胞悬液，且单细胞悬液不易运输，因为运输过程中无法保证细胞活率。目前的实现方法是携带单细胞分离设备至医院，手术切下的新鲜组织立即进行消化及后续的分离处理，使该实验在成本、时间、地点等方面受到较大限制。因此有必要开发一种新的样本处理方法，更便捷地获得合适的样本进行单细胞转录组测序。将新鲜组织用液氮冷冻为冰冻组织后可用干冰运输及保存，但解冻后难以消化获得高活率的单细胞悬液。在新鲜组织快速冷冻及冷冻保存的过程中会对细胞膜造成较大的损伤，细胞内RNA游离损失，导致无法进行单细胞RNA测序，而核膜在冻融的过程中可以保持完整。有研究证明细胞核中包含足够量的RNA，可用于测序，且与用完整细胞进行RNA测序具有较高的相关性。由于核膜比细胞膜更易保持完整，与获得单细胞悬液相比，从冰冻组织中获得细胞核悬液的可操作性更强。目前从冰冻组织中获得单核悬液还没有成熟稳定的方法，目前仅有通过昂贵的辅助设备针对冰冻脑组织的单核悬液分离方法，且没有质控结果的展示说明。随着肿瘤免疫治疗的大规模开展，单细胞测序可以对肿瘤微环境进行深入系统的研究分析包括预测对免疫治疗的有效人群。因而，开发一种简单、方便的分离人冰冻肿瘤组织细胞核，获得高活率的单细胞核悬液的方法迫在眉睫。
技术实现思路
本申请是基于专利技术人以上事实和问题的发现和认识作出的：本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，专利技术人开发了一种简便的方法，可以从冰冻肿瘤组织样本中获得适用于单细胞测序的单核悬液，解除新鲜肿瘤组织单细胞测序对时间地点的限制，使单细胞测序技术可以更广泛地应用于肿瘤微环境的研究。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种提取细胞核的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将待提取样品进行裂解处理，所述裂解处理是在第一缓冲液中进行的；将裂解产物进行第一离心处理，以便获得细胞核沉淀；将所述细胞核沉淀进行冲洗和重悬处理，冲洗和重悬处理是在第二缓冲液中进行的，以便获得所述细胞核；其中，所述第一缓冲液包括：116.8mMNaCl、pH7.8的8mMTris碱、0.8mMCaCl2、38mMMgCl2、0.04％BSA(该％是质量体积比，单位为g/100mL，例如在100mL缓冲液中加入0.04gBSA可配置0.04％BSA)、0.16％NonidetP-40(该％是体积比，单位为mL/100mL，例如在100mL缓冲液中加入0.16mLNonidetP-40可配置0.04％NonidetP-40)、1mMEDTA、1mg/mLDAPI；所述第二缓冲液包括：1×PBS、1.0％BSA(该％是质量体积比，单位为g/100mL，例如在100mL缓冲液中加入1gBSA可配置1.0％BSA)以及0.2U/μLRNase抑制剂。其中，在本专利技术中，第一缓冲液又称为NSTlysisbuffer，是通过如下方式制备的，分别配制以下两组分后合并混匀：1)80mLofNST：146mMNaCl,10mMTrisbaseatpH7.8,1mMCaCl2,21mMMgCl2,0.05％BSA,0.2％NonidetP-40)；2)20mL的106mMMgCl2,5mMEDTA，1mg/mLDAPI。专利技术人发现，第二缓冲液中的BSA的存在，能保护核膜的完整性。根据本专利技术实施例的方法只需简单的试剂耗材，不需要昂贵的分离设备，就可从较少的冰冻肿瘤组织中获得足量的、完整的单核用于单细胞RNA测序，进而根据本专利技术实施例的方法所获得的细胞核悬液适用于单细胞RNA测序，可应用于难以获得新鲜组织、可用冰冻组织代替的样本进行单细胞层面的肿瘤异质性等研究。根据本专利技术的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述第一缓冲液以及第二缓冲液预先经过4℃预冷处理。根据本专利技术的实施例，所述待提取样品为冰冻肿瘤组织，所述待提取样品与所述第一缓冲液的质量体积比为30mg:3mL。进而，能使得样品裂解更充分。根据本专利技术的实施例，所述裂解处理是通过如下方式进行的：将所述待提取样品在所述第一缓冲液中进行机械破碎处理，破碎处理后的样品大小不大于1mm3；将机械破碎处理产物冰置处理30min，每5min混匀；将冰置处理产物进行10～15次吹打处理，并将所述吹打处理产物进行第一过滤处理，所述第一过滤处理是通过直径为37μm的细胞过滤器进行的，所述第一过滤处理后的滤液构成所述裂解产物。专利技术人发现，破碎处理后的样品大小大于1mm3，则会导致裂解不充分，核回收率低。根据本专利技术的实施例，所述第一离心处理是在4℃、500g的条件下进行5min。由此，能在不影响核膜完整性的条件下，增加裂解产物的回收率。根据本专利技术的实施例，所述冲洗和重悬处理是通过如下方式进行的：将所述细胞核沉淀在所述第二缓冲液中进行第一重悬处理，所述第二缓冲液的用量为5mL；将第一重悬处理产物进行第二过滤处理；将第二过滤处理的滤液进行第二离心处理，所述第二离心处理是在4℃、500g的条件下进行5min；将第二离心处理后的沉淀进行第二重悬处理以及第三过滤处理。根据本专利技术的实施例，在所述第一重悬处理中，将重悬液进行反复吹吸10次。由此细胞核沉淀与第二缓冲液能混合均匀。根据本专利技术的实施例，所述第二、第三过滤处理是通过直径为37μm的细胞过滤器进行的。由此，能过滤掉细胞碎片和组织团。根据本专利技术的实施例，所述冲洗和重悬处理后，进一步包括将第三过滤处理后的滤液进行梯度离心处理。根据本专利技术的实施例，所述梯度离心是在蔗糖缓冲液I中进行的。根据本专利技术的实施例，所述蔗糖缓冲液I包括：1.35mlNucleiPURE2M蔗糖缓冲液和150μlNucleiPURE缓冲液。根据本专利技术的实施例，所述梯度离心是通过如下方式进行的：往所述第三过滤处理后的滤液中加入所述蔗糖缓冲液I，吹吸混匀10次；将吹吸混匀10次后的滤液加入到所述蔗糖缓冲液I上层，不要混匀，以便得到分层液；将所述分层液在温度为4℃、速度为13000g的条件下离心处理45min；将离心处理后的产物去上清，以便获得所述细胞核。由此，能进一步去除本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提取细胞核的方法，其特征在于，将待提取样品进行裂解处理，所述裂解处理是在第一缓冲液中进行的；将裂解产物进行第一离心处理，以便获得细胞核沉淀；将所述细胞核沉淀进行冲洗和重悬处理，冲洗和重悬处理是在第二缓冲液中进行的，以便获得所述细胞核；其中，所述第一缓冲液包括：116.8mM NaCl、pH 7.8的8mM Tris碱、0.8mM CaCl2、38mM MgCl2、0.04％BSA、0.16％Nonidet P‑40、1mM EDTA、1mg/mL DAPI；所述第二缓冲液包括：1×PBS、1.0％BSA以及0.2U/μL RNase抑制剂。
【技术特征摘要】
1.一种提取细胞核的方法，其特征在于，将待提取样品进行裂解处理，所述裂解处理是在第一缓冲液中进行的；将裂解产物进行第一离心处理，以便获得细胞核沉淀；将所述细胞核沉淀进行冲洗和重悬处理，冲洗和重悬处理是在第二缓冲液中进行的，以便获得所述细胞核；其中，所述第一缓冲液包括：116.8mMNaCl、pH7.8的8mMTris碱、0.8mMCaCl2、38mMMgCl2、0.04％BSA、0.16％NonidetP-40、1mMEDTA、1mg/mLDAPI；所述第二缓冲液包括：1×PBS、1.0％BSA以及0.2U/μLRNase抑制剂。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一缓冲液以及第二缓冲液预先经过4℃预冷处理；任选地，所述待提取样品为冰冻肿瘤组织，所述待提取样品与所述第一缓冲液的质量体积比为30mg:3mL。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述裂解处理是通过如下方式进行的：将所述待提取样品在所述第一缓冲液中进行机械破碎处理，破碎处理后的样品大小不大于1mm3；将机械破碎处理产物冰置处理30min，每5min混匀；将冰置处理产物进行10～15次吹打处理，并将所述吹打处理产物进行第一过滤处理，所述第一过滤处理是通过直径为37μm的细胞过滤器进行的，所述第一过滤处理后的滤液构成所述裂解产物。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一离心处理是在4℃、500g的条件下进行5min。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冲洗和重悬处理是通过如下方式进行的：将所述细胞核沉淀在所述第二缓冲液中进行第一重悬处理，所述第二缓冲液的用量为5mL；将第一重悬处理产物进行第二过滤处理；将第二过滤处理的滤液进行第二离心处理，所述第二离心处理是在4℃、500g的条件下进行5min；将第二离心处理后的沉淀进行第二重悬处理以及第三过滤处理；优选地，在所述第一重悬处理中，将重悬液进行反复吹吸10次；优选地，所述第二、第三过滤处理是通过直径为37μm的细胞过滤器进行的。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述冲洗和重悬处理后，进一步包括将第三过滤处理后的滤液进行梯度离心处理。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述梯度离心是在蔗糖缓冲液I中进行的；任选地，所述蔗糖缓冲液I包括：1.35mlNucleiPURE2M蔗糖缓冲液和150μlNucleiPURE缓冲液；任选地，所述梯度离心是通过如下方式进行的：往所述第三过滤处理后的滤液中加入所述蔗糖缓冲液I，吹吸混匀10次；将吹...
【专利技术属性】
技术研发人员：林锐，郭成林，
申请(专利权)人：杭州瑞普基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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