一种快速鉴定和筛选抗尖孢镰刀菌枯萎病植株的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种快速鉴定和筛选抗尖孢镰刀菌枯萎病植株的方法及其应用。该方法使用镰刀菌酸处理植株叶片，不黄化或黄化部分少于10％的植株叶片对应的植株即为抗枯萎病植株。该方法不仅能快速准确地鉴定筛选出抗枯萎病的植株，且该方法无需依赖于成熟的组织或是细胞培养，更无需将整株植株用于离体鉴定筛选，也无需对植株进行恢复或再生培养，对植株没有任何影响，因而更方便、且能大量节省人力、控制成本、更易实现；同时，该方法不受自然气候及病害是否发生的影响，且几乎不产生实验垃圾，因而更环保；该方法对植株的子叶进行处理，因而能大大缩短整个鉴定及筛选周期。

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定和筛选抗尖孢镰刀菌枯萎病植株的方法及其应用
本专利技术涉及农业
，尤其涉及一种快速鉴定和筛选抗尖孢镰刀菌枯萎病植株的方法及其应用。
技术介绍
由尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)引发的枯萎病已成为危害瓜类产量和品质、制约瓜类产业进一步发展的严重障碍，瓜类产量每年因此损失15％～30％。采用化学防治枯萎病效果并不理想，同时也增加了生产成本，残留的农药还给生态环境和食品安全带来隐患；倒茬嫁接虽常用于防控但增添了技术困难和劳动成本，因而选育抗病品种被认为是解决枯萎病危害的重要途径。瓜类枯萎病抗性的鉴评是开展枯萎病抗性育种的重要内容及前提条件。目前，研究人员主要采用田间病圃筛选鉴定和苗期人工接种枯萎病菌两类方法进行瓜类枯萎病抗性材料的评价和筛选。田间或温室病圃法占地多、时间长、工作量大、易受不同年份、不同季节气候变化的限制和影响，导致实验结果易受环境条件的影响而不稳定。人工接种尖孢镰刀菌法主要有胚根接种、浸根接种和灌根接种。通常认为最高效的接种方法是浸根接种，最适宜瓜类枯萎病感染的孢子数浓度为107个/mL。病害的症状通常会在接种后的7～14天出现，病害分级标准通常为5级，0级：无症状，根、茎、叶生长正常；1级：胚轴及子叶症状轻微，子叶黄化，不萎蔫，1/4以下根、茎变黄，植株稍有矮化；2级：子叶萎蔫或植株轻度萎蔫，胚轴出现坏死斑或一片叶子黄化，1/4～1/2根、茎变黄，下部叶脉褪色；3级：子叶下垂或僵化，植株中度萎蔫或矮化，1/2～3/4根、茎变黄，茎基纵裂；4级：3/4以上根、茎变黄或直接枯萎死亡。群体或品种抗病性划分标准参考李树德[1]的标准，病情指数＝Σ(病情严重程度×株数)/(最高病情严重程度×调查总株数)×100；按病情指数划分：0～15为高抗(HR)；15～30为抗病(R)；30～55为中抗(MR)；55～70为感病(S)；70～100为高感(HS)。然而，上述人工接种尖孢镰刀菌的方法也存在一些明显的不足之处，如：实验过程繁琐冗长、工作量大、根据早期发病指数筛选出的抗/感单株由于染菌而很难存活留种，对于接菌侵染后的病情划分即发病指数易受环境和主观因素的影响而导致实验结果似是而非，需要多次重复才能取得让人信服的结论，另外该方法还会产生大量有菌的实验垃圾(病株和栽培用土等)，需要严格的隔离和后续处理措施，以防病菌扩散。镰刀菌酸别名萎蔫酸，化学名称为5-丁基-2-吡啶甲酸，是包括有120多种专化型的尖孢镰刀菌在内的镰刀菌属的许多真菌产生的一种非寄主特异性毒素，在尖孢镰刀菌对植物致病过程中起重要作用。CN1287660C利用镰刀菌酸作为离体胁迫剂与节瓜不定芽分化培养基配制筛选培养基，对已建立的节瓜无性繁殖系进行抗性离体筛选，获得对镰刀菌酸具有抗性的无性繁殖系，将具有抗性的无性繁殖系的不定芽切下，在生根培养基上诱导生根，形成再生植株，即为抗性变异体，该方法是在组织和细胞水平进行筛选，需要依赖成熟的离体组织和细胞培养水平；CN101647389B则利用镰刀菌酸对切除部分须根的节瓜幼苗茎基进行处理后将尚存活无萎蔫或极少萎蔫的幼苗在常规育苗条件下进行恢复培养，待幼苗恢复生长后移栽到田间即可，该方法需整株植株进行离体筛选，且后续还需对具有抗性的离体植株进行恢复培养，因而存在操作繁琐，人工花费大，且对植株还存在一定破坏性的影响，另外该方法还需控制须根的切除量，因而存在不确定因素，易导致对结果的误判。因此，提供一种操作简单，且能快速可靠地鉴定及筛选抗枯萎病植株的方法，对于瓜类枯萎病的研究和抗枯萎病分子育种具有重要的现实意义。[1]李树德,方智远,李明远,等.中国主要蔬菜抗病育种进展[M].北京:科学出版社，1995:420－421,439－444.
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速鉴定和筛选抗尖孢镰刀菌枯萎病植株的方法及其应用。本专利技术针对现有技术中存在的问题，利用镰刀菌酸(FA)处理离体的植株叶片，即可快速可靠地鉴定及筛选出抗尖孢镰刀菌枯萎病的植株，该方法无需依赖于成熟的组织或细胞培养技术，更无需将整株植株进行离体筛选，对植株无任何破坏性影响，因而更方便快捷。具体而言，本专利技术的目的之一在于提供一种快速鉴定和筛选抗尖孢镰刀菌枯萎病植株的方法。该方法使用镰刀菌酸处理离体的植株叶片，不黄化或黄化部分少于10％的植株叶片对应的植株即为抗尖孢镰刀菌枯萎病植株。本专利技术只需将离体的植株叶片放入镰刀菌酸溶液中浸泡即可。优选地，镰刀菌酸的浓度为2～6mmol/L。更优选地，镰刀菌酸的浓度为2.5～3.5mmol/L。镰刀菌酸溶液的配制过程为：先利用少量无水乙醇溶解镰刀菌酸，制成存储液置于-20℃，后加入培养液配制成实验需要的镰刀菌酸处理溶液。优选地，上述植株叶片为植株子叶。优选地，上述植株子叶为7～12日龄的植株子叶。更优选地，上述植株子叶为平展不褶皱、厚度均匀的子叶。优选地，镰刀菌酸处理植株叶片的时间为6h以上。优选地，镰刀菌酸处理植株叶片的时间为18～36h。更优选地，镰刀菌酸处理植株叶片的时间为24h。优选地，镰刀菌酸处理植株叶片的温度为25℃～28℃。优选地，上述植株为子叶平展，厚度均匀的瓜类植株。更优选地，上述植株为对尖孢镰刀菌的抗性与其对镰刀菌酸的抗性一致的黄瓜品系的植株。本专利技术的另一个方面还涉及上述黄瓜植株的培育方法，其具体步骤包括为：先将种子进行浸泡，后进行催芽、播种、培育。优选地，种子浸泡前还包括对种子进行消毒处理。优选地，浸泡温度为55℃，浸泡时间为10～30min。优选地，催芽温度为30℃，催芽时间为18-36h。更优选地，催芽温度为30℃，催芽时间为24h。优选地，在光暗交替保湿的条件下进行培育。优选地，光暗交替条件为：25～30℃光照8～16h，20～25℃黑暗环境16～8h。更优选地，光暗交替条件为：28℃光照12h，25℃黑暗环境12h。优选地，保湿条件为：保持相对湿度为75～85％。本专利技术的另一目的在于提供上述方法的应用。上述方法在抗尖孢镰刀菌枯萎病育种中的应用。一种抗尖孢镰刀菌枯萎病育种的方法，使用镰刀菌酸在植株杂交的F2代中筛选不黄化的或黄化部分少于10％的植株叶片对应的植株进行枯萎病抗性育种。上述方法在定位抗尖孢镰刀菌枯萎病抗性基因中的应用。本专利技术的有益效果是：1、针对对尖孢镰刀菌的抗性与其对镰刀菌酸的抗性一致的黄瓜材料，本专利技术利用镰刀菌酸处理离体的植株叶片即可快速准确地鉴定筛选出抗尖孢镰刀菌枯萎病的植株，且该方法无需依赖于成熟的组织或是细胞培养技术，更无需将整株植株用于离体鉴定筛选，也无需对植株进行恢复或再生培养，对候选植株没有任何伤害，也不影响后续的进一步鉴定筛选，因而更方便、且能大量节省人力、控制成本、更易实现。2、本专利技术的鉴定筛选方法不受自然气候条件，年份及病害是否发生的影响，且该方法占地面积小，可节省土地，同时本专利技术几乎不会产生实验垃圾，因而更环保。3、本专利技术利用镰刀菌酸对植株的子叶进行处理，在早期即可鉴定筛选出抗病植株，因而能大大缩短整个鉴定及筛选周期。附图说明图1为镰刀菌酸(FA)处理前(-)和处理后(+)的黄瓜材料颜色对比图；图2为筛选F2群体中的高抗、高感尖孢镰刀菌枯萎病的颜色参考图，R++为高抗尖孢镰刀菌枯萎病的颜色(叶盘边缘有微弱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速鉴定和筛选抗尖孢镰刀菌枯萎病植株的方法，其特征在于：使用镰刀菌酸处理离体的植株叶片，不黄化或黄化部分少于10％的植株叶片对应的植株即为抗尖孢镰刀菌枯萎病植株。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定和筛选抗尖孢镰刀菌枯萎病植株的方法，其特征在于：使用镰刀菌酸处理离体的植株叶片，不黄化或黄化部分少于10％的植株叶片对应的植株即为抗尖孢镰刀菌枯萎病植株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述镰刀菌酸的浓度为2～6mmol/L。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述镰刀菌酸的浓度为2.5～3.5mmol/L。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植株叶片为植株子叶。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：镰刀菌酸处理植...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚春鹏，张晓爱，张长远，吴廷全，林毓娥，谢大森，金庆敏，
申请(专利权)人：广东省农业科学院蔬菜研究所，广东省农业科学院农业生物基因研究中心，
类型：发明
国别省市：广东,44