一种细菌漆酶传感器及在检测高浓度酚类底物的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种细菌漆酶传感器的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：S1：细菌漆酶CotA的表达获取；S2：细菌漆酶传感电极的构建；本发明专利技术提供的一种细菌漆酶传感器，能够实现对高浓度酚类物质的检测，检测结果准确且稳定性高。

【技术实现步骤摘要】
一种细菌漆酶传感器及在检测高浓度酚类底物的应用
本专利技术涉及生物传感领域，更具体是一种细菌漆酶传感器及在检测高浓度酚类底物的应用。
技术介绍
酚类底物广泛存在于工业废水中，对环境和人类健康造成极大危害。例如，对苯二酚是一种广泛使用的化学品，即使很低的浓度也会对人类和动植物健康造成巨大危害。目前，漆酶制备的电化学生物传感器由于其对酚类底物的催化氧化特性，精确的检测能力以及没有副产物如过氧化氢等物质产生等优点被广泛应用对苯二酚的检测中。而普通制备的漆酶传感器电极的稳定性较差，不能在极端环境中使用和寿命较短一直是其最难以解决的问题。细菌漆酶相较于真菌漆酶来说，细菌漆酶比酶活和氧化还原电势普遍偏低，限制了其作为酶分子元件的传感电极的检测性能。因此，构建针对酚类底物检测的细菌漆酶传感器具有实际应用意义。因此，本领域有待开发出一款新型的细菌漆酶传感器，具有高稳定性，测定的浓度范围宽，能够实现在极端情况下对高浓度酚类物质浓度精确的测定。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种细菌漆酶传感器的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：S1：细菌漆酶CotA的表达获取；S2：细菌漆酶传感电极的构建。作为一种优选的技术方案，所述细菌漆酶CotA的表达获取，包含如下步骤：A1：对细菌漆酶进行全基因提取，利用设计引物对目的基因CotA的PCR扩增获得目的基因序列；A2：利用一部克隆方法对A1所获得的目的基因与出发载体连接构建表达载体；A3：用宿主菌构建含有CotA基因的基因工程菌，高效表达细菌漆酶基因；A4：采用预处理和浓缩手段对A3所得到的细菌漆酶基因进行纯化，获得目的蛋白纯蛋白。作为一种优选的技术方案，所述直接电化学型细菌漆酶传感电极的构建，包含如下步骤：B1：将金电极进行预处理，进行电化学测试。达到电化学实验要求后，将金电极进行清洗；B2：将B1所得到的金电极置于修饰电极混合液中进行表面修饰。作为一种优选的技术方案，所述细菌漆酶选自Bacillussubtilis168。作为一种优选的技术方案，所述出发载体为pPIC9k，所述表达载体为pPIC9k-cotA。作为一种优选的技术方案，所述宿主菌为P.pastorisGS115，所述基因工程菌为pastorisGS115/CotA。作为一种优选的技术方案，所述pastorisGS115/CotA的构建方法，包含如下步骤：C1：将含细菌漆酶CotA基因的pPIC9k-cotA重组质粒转化到表达宿主菌P.pastorisGS115获得重组微生物pastorisGS115/CotA；C2：将C1所获得的重组微生物转接到含有ABTS、G418的平板，培养，挑取阳性转化子，保存。作为一种优选的技术方案，所述修饰电极混合液为多壁碳纳米管-壳聚糖-ABTS溶液。作为一种优选的技术方案，所述多壁碳纳米管-壳聚糖-ABTS溶液的制备方法，包含如下步骤：D1：将壳聚糖在醋酸溶液中溶解，得到壳聚糖溶液；D2：加入纯化后的多壁碳纳米管粉末，搅拌均匀，得到多壁碳纳米管-壳聚糖溶液；D3：在D2得到的多壁碳纳米管-壳聚糖溶液中添加ABTS，搅拌均匀，过夜进行负载，得到多壁碳纳米管-壳聚糖-ABTS溶液。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了细菌漆酶传感器的制备方法在高浓度酚类检测中的应用。所述的酚类底物包括多苯二酚，邻苯二酚、间苯二酚及2，6-二甲氧基苯酚等。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种细菌漆酶传感器，稳定性高，对与高浓度范围的酚类物质具有极高的准确性，此外，本专利技术还能够克服现有技术对于低浓度下检测性能不佳的缺陷，并且能够简化目的蛋白的获取，大大的提升了在现实应用中的可操作性。附图说明图1是修饰电极对对不同浓度的对苯二酚循环伏安曲线；其中，1代表0.8mmol，2代表0.4mmol，3代表0.2mmol，4代表0.1mmol，5代表0。图2是构建的传感电极对不同浓度的对苯二酚电流—浓度响应曲线；其中，1代表0.25mmol，2代表0.5mmol，3代表1mmol，4代表2mmol。图3是构建的传感电极对不同浓度的对苯二酚电流—浓度响应曲线。图4是构建的细菌漆酶传感电极与真菌漆酶电极稳定性性能比较，其中圆点代表TvLc/ABTS/MWCNTs/CS/GCE，方点代表CotA/ABTS/MWCNTs/CS/GCE。具体实施方式为了下面的详细描述的目的，应当理解，本专利技术可采用各种替代的变化和步骤顺序，除非明确规定相反。此外，除了在任何操作实例中，或者以其他方式指出的情况下，表示例如说明书和权利要求中使用的成分的量的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非相反指出，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是根据本专利技术所要获得的期望性能而变化的近似值。至少并不是试图将等同原则的适用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的个数并通过应用普通舍入技术来解释。尽管阐述本专利技术的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实例中列出的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地包含由其各自测试测量中发现的标准偏差必然产生的某些误差。此外，应当理解，本文所述的任何数值范围旨在包括归入其中的所有子范围。例如，“1至10”的范围旨在包括介于(并包括)所述最小值1和所述最大值10之间的所有子范围，即具有等于或大于1的最小值和等于或小于10的最大值。说明书中一些缩写的意义如下：MWCNTs：多壁碳纳米管；CS：壳聚糖；GC：玻碳电极；ABTS：2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种细菌漆酶传感器的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：S1：细菌漆酶CotA的表达获取；S2：细菌漆酶传感电极的构建。在具体的实施方式中，所述细菌漆酶CotA的表达获取，包含如下步骤：A1：对细菌漆酶进行全基因提取，利用设计引物对目的基因CotA的PCR扩增获得目的基因序列；A2：利用一部克隆方法对A1所获得的目的基因与出发载体连接构建表达载体；A3：用宿主菌构建含有CotA基因的基因工程菌，高效表达细菌漆酶基因；A4：采用预处理和浓缩手段对A3所得到的细菌漆酶基因进行纯化，获得目的蛋白纯蛋白。所述A1中，引物的设计采用的是本领域常规技术手段。PCR技术是指对特定基因进行体外合成，并用于以检测DNA/RNA为目的的各种基因。所述预处理和浓缩手段为本领域常规技术手段，在这里不做赘述。在具体的实施方式中，对Bacillussubtilis168进行全基因提取，PCR扩增产物纯化回收，酶切产物纯化回收和质粒提取均按照所使用试剂盒的说明书进行。具体方法按以下步骤进行。细菌漆酶CotA基因在P.pastorisGS115中的高效表达：(1)细菌漆酶CotA基因的PCR扩增：根据NCBI公布的Bacillussubtilis168中CotA的基因序列(对应的GenBankAccessionNo.为BSU_06300)，使用引物设计软件PrimerPremier设计了扩增CotA的引物CotA-9k-f(CTGAAGCTTACGTAGAATTCATGACACTTGAAAAATTTGTGGA)和cotA-9k-r(GCGGCCGCCCTAGGGAATTCGTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细菌漆酶传感器的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：S1：细菌漆酶CotA的表达获取；S2：细菌漆酶传感电极的构建。

【技术特征摘要】
1.一种细菌漆酶传感器的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：S1：细菌漆酶CotA的表达获取；S2：细菌漆酶传感电极的构建。2.权利要求1所述的细菌漆酶传感器的制备方法，其特征在于，所述细菌漆酶CotA的表达获取，包含如下步骤：A1：对细菌漆酶进行全基因提取，利用设计引物对目的基因CotA的PCR扩增获得目的基因序列；A2：利用一部克隆方法对A1所获得的目的基因与出发载体连接构建表达载体；A3：用宿主菌构建含有CotA基因的基因工程菌，高效表达细菌漆酶基因；A4：采用预处理和浓缩手段对A3所得到的细菌漆酶基因进行纯化，获得目的蛋白纯蛋白。3.权利要求1所述的细菌漆酶传感器的制备方法，其特征在于，所述直接电化学型细菌漆酶传感电极的构建，包含如下步骤：B1：将金电极进行预处理，进行电化学测试。达到电化学实验要求后，将金电极进行清洗；B2：将B1所得到的金电极置于修饰电极混合液中进行表面修饰。4.权利要求2所述的细菌漆酶传感器的制备方法，其特征在于，所述细菌漆酶选自Bacillussubtilis168。5.权利要求2所述的细菌漆酶传感器的制备方法，其特征在于，所述出发载体为pPIC9k，所述表达载体为pPIC9k-cotA。6.权利要求2所述的细菌漆酶传感器的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：董维亮，张越，周杰，吴昊，方艳，姜岷，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32