一种多杀菌素的生产方法技术

本发明专利技术提供了一种多杀菌素的生产方法，属于发酵工程技术领域，该方法通过优化多杀菌素的发酵及分离纯化过程，包括在发酵培养液中加入卵磷脂、优化培养基组分及培养条件、在发酵过程中进行物料的补加以及分离纯化过程中的提取工艺的改进，增加了刺糖多孢菌的活性，同时提高了其产率与纯度，具有环境污染小、成本低、效率高、工艺简单等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种多杀菌素的生产方法
本专利技术属于发酵工程
，具体涉及一种多杀菌素的生产方法。
技术介绍
多杀菌素是在多刺甘蔗多孢菌发酵液中提取的一种大环内酯类无公害高效生物杀虫剂。多杀菌素作为一种广谱的生物农药，具有高效、低毒、低残留、易降解以及对非靶标动物无害等优点，同时对哺乳动物也并无致癌、致畸或致突变等作用。目前，发酵工艺复杂、效能低、成本高是制约多杀菌素大规模生产的主要问题，而培养基优化以及菌株改造是提高发酵产率，是降低发酵成本的主要方法。通常，菌株改造的技术要求较高、不易实施，培养基的优化由于可选择性较广，而被普遍采用。论文利用混料设计优化多杀菌素发酵培养基[J],阎宝清,夏立秋,龙如花,etal,食品与机械,2014(4):200-203.利用Plackett-Burman试验设计从8种营养成分中筛选出葡萄糖、棉籽粉、玉米浆及豆饼粉，通过D-最优混料设计，确定了四种成分的最佳比例，即葡萄糖59g/L、棉籽粉28g/L、玉米浆6.5g/L和豆饼粉6.5g/L，多杀菌素最高理论产量为256.75mg/L，实际产量为249.9mg/L。但该论文仅针对培养基组分配比进行了研究，却并未研究pH、发酵温度及发酵周期等因素的协同作用同样也会影响多杀菌产率。而有关多杀菌素的分离纯化方法，目前为止主要有两种，溶媒萃取法和树脂吸附提取法，前者将发酵液中的多杀菌素吸附后利用有机溶剂将其从吸附剂中洗脱，再经浓缩得到多杀菌素，该方法处理量大、耗时短且成本低廉，但大都在实验室阶段，无法投入在工业化生产中；而后者则利用多杀菌素与杂质在溶媒中不同的溶解度，将多杀菌素从一种溶剂转移到另一种溶剂，进而浓缩去杂质，该方法处理效果较好且纯度较高，但该方法对设备要求较高，且在大规模生产中处理量较小，且面临着成本高、耗时长等问题。申请号为201310756417.6的专利公开了一种多杀菌素的补料发酵及分离纯化方法，该方法包括将能提高多杀菌素产率的基因工程菌经斜面培养及种子培养后将种子液接种到发酵培养基中，进行一次补加玉米浆和油脂，二次补加玉米浆，分离提纯时，向发酵液加入丙酮进行离心，并用大孔树脂吸附，再用丙酮洗脱，经历超滤、纳滤、乙酸乙酯萃取、蒸发后得到多杀菌素。该专利技术通过补加混合油脂能够提高多杀菌素的产率并降低成本，但该方法的分离纯化过程中如超滤、纳滤等步骤对设备要求较高且处理量较小，同时，过程中使用的丙酮等物质，有毒有害、威胁健康并造成环境污染。申请号为201410298686.7的专利公开了一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的方法，该方法包括对刺糖多孢菌液预处理、吸附剂吸附离心后水相中的有机物、合并离心分离后的固体、提取多杀菌素以及重结晶得到多杀菌素。该专利技术减少了有机溶剂的使用量，减少环境污染的同时降低了成本。但该专利技术在提取过程中，索氏提取通常提取时间较长且产率低，而重结晶过程将消耗部分正戊烷、正己烷、环己烷或石油醚等，溶剂消耗量大，会对环境造成影响。目前为止，多杀菌素的生产存在工艺复杂、成本高、环境污染等各类问题，制备出的多杀菌通常产率及纯度也较低，因此，需要对多杀菌素的生产过程进行进一步优化，进而提高多杀菌素产率、纯度，同时简化工艺、降低成本及溶剂消耗，避免环境污染问题的发生。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的问题，提供了一种多杀菌素的生产方法，该方法通过优化多杀菌素的发酵及分离纯化过程，增加了刺糖多孢菌的活性，同时提高了其产率与纯度，具有环境污染小、成本低、效率高、工艺简单等优点。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种多杀菌素的生产方法，该方法包括：(1)发酵：S1：斜面培养：将刺糖多孢菌在斜面培养基上培养制成孢子悬液；S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液接种于种子活化培养基中，得到种子液；S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液转入发酵培养基中，依次进行三次物料补加，第一次补加植物油和卵磷脂，第二次补加葡萄糖和玉米浆，第三次补加玉米浆，得到发酵液；(2)分离、纯化：S4：发酵液预处理：向发酵液中加入碱液，调节pH并搅拌，离心得到固体A和清液；S5：吸附剂吸附：向步骤S4得到的清液中加入大孔网状吸附剂，加热搅拌后离心，得到固体B；S6：混合干燥：将步骤S4得到的固体A与步骤S5得到的固体B混合，然后真空干燥，得到干燥后的混合物；S7：索氏提取：将步骤S6得到的干燥后的混合物加入提取剂浸渍，同时超声，进行第一阶段回流提取后再次浸渍，而后进行第二阶段回流提取，旋转蒸发得到浓缩液；S8：析晶、分离及干燥：调节步骤S7中浓缩液的pH得到结晶液，而后离心得到湿晶，将湿晶干燥后得到多杀菌素。在一些具体的实施方案中，步骤S1所述的斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物3g/L、无机盐0.2g/L和琼脂粉16g/L；优选地，所述的无机盐为MgSO4·7H2O。进一步地，步骤S1所述的斜面培养，培养温度为28℃，转速为150r/min，培养周期为10d，pH为6.5。在一些具体的实施方案中，步骤S2所述的种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物4g/L、酪蛋白胨25g/L和无机盐1.5g/L；优选地，所述的无机盐为MgSO4·7H2O与K2HPO4，其中，MgSO4·7H2O为0.2g/L，K2HPO4为1.3g/L。进一步地，步骤S2所述的孢子悬液以体积比为1％的接种量转入种子活化培养基中；所述的种子活化培养基共50mL，装于250mL的摇瓶中。进一步地，步骤S2所述的种子培养，培养温度为30℃，转速为250r/min，培养周期为2d，pH为6。进一步地，步骤S3所述的种子液以体积比为10％的接种量转入发酵培养基中；所述的发酵培养基共20mL，装于250mL的摇瓶中。进一步地，步骤S3所述的第一次补加卵磷脂和植物油，各组分按质量浓度计，分别为：卵磷脂2g/L和植物油1g/L；所述的第二次补加葡萄糖与玉米浆，各组分按质量浓度计，分别为：葡萄糖3g/L和玉米浆1g/L，所述的第三次补加玉米浆的质量浓度为0.5g/L；所述的第一次补加在发酵2-3d时，所述的第二次补加在发酵4-7d时，所述的第三次补加在发酵8-9d时。进一步地，步骤S3所述的植物油为玉米油、花生油、大豆油、橄榄油、菜籽油和葵花籽油中的一种或多种；优选地，步骤S3所述的植物油为大豆油与橄榄油按质量比2:1的比例混合而成；进一步地，所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖30-40g/L、可溶性淀粉15-20g/L、玉米浆8-12g/L、棉籽粉3-8g/L、豆饼粉3-8g/L、植物油15-20g/L、无机盐1-2g/L和卵磷脂0.5-1g/L；优选地，步骤S3所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖36g/L、可溶性淀粉18g/L、玉米浆10g/L、棉籽粉5g/L、豆饼粉5g/L、植物油18g/L、无机盐1.5g/L和卵磷脂0.8g/L。进一步地，步骤S3所述的发酵培养条件，发酵温度为25-35℃、溶解氧为40％-60％、pH为7-8、培养周期为7-9d、转速为120-250r/min；优选地，步骤S3所述的发酵培养条件，发酵温度为30℃、溶解氧为50％、p本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多杀菌素的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)发酵：S1：斜面培养：将刺糖多孢菌在斜面培养基上培养制成孢子悬液；S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液接种于种子活化培养基中，得到种子液；S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液转入发酵培养基中，依次进行三次物料补加，第一次补加植物油和卵磷脂，第二次补加葡萄糖和玉米浆，第三次补加玉米浆，得到发酵液；(2)分离、纯化：S4：发酵液预处理：向发酵液中加入碱液，调节pH并搅拌，离心得到固体A和清液；S5：吸附剂吸附：向步骤S4得到的清液中加入大孔网状吸附剂，加热搅拌后离心，得到固体B；S6：混合干燥：将步骤S4得到的固体A与步骤S5得到的固体B混合，然后真空干燥，得到干燥后的混合物；S7：索氏提取：将步骤S6得到的干燥后的混合物加入提取剂浸渍，同时超声，进行第一阶段回流提取后再次浸渍，而后进行第二阶段回流提取，旋转蒸发得到浓缩液；S8：析晶、分离及干燥：调节步骤S7中浓缩液的pH得到结晶液，而后离心得到湿晶，将湿晶干燥后得到多杀菌素。

【技术特征摘要】
1.一种多杀菌素的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)发酵：S1：斜面培养：将刺糖多孢菌在斜面培养基上培养制成孢子悬液；S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液接种于种子活化培养基中，得到种子液；S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液转入发酵培养基中，依次进行三次物料补加，第一次补加植物油和卵磷脂，第二次补加葡萄糖和玉米浆，第三次补加玉米浆，得到发酵液；(2)分离、纯化：S4：发酵液预处理：向发酵液中加入碱液，调节pH并搅拌，离心得到固体A和清液；S5：吸附剂吸附：向步骤S4得到的清液中加入大孔网状吸附剂，加热搅拌后离心，得到固体B；S6：混合干燥：将步骤S4得到的固体A与步骤S5得到的固体B混合，然后真空干燥，得到干燥后的混合物；S7：索氏提取：将步骤S6得到的干燥后的混合物加入提取剂浸渍，同时超声，进行第一阶段回流提取后再次浸渍，而后进行第二阶段回流提取，旋转蒸发得到浓缩液；S8：析晶、分离及干燥：调节步骤S7中浓缩液的pH得到结晶液，而后离心得到湿晶，将湿晶干燥后得到多杀菌素。2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S3所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖30-40g/L、可溶性淀粉15-20g/L、玉米浆8-12g/L、棉籽粉3-8g/L、豆饼粉3-8g/L、植物油15-20g/L、无机盐1-2g/L和卵磷脂0.5-1g/L。3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于：所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖36g/L、可溶性淀粉18g/L、玉米浆10g/L、棉籽粉5g/L、豆饼粉5g/L、植物油18g/L、无机盐1.5g/L和卵磷脂0.8g/L。4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S3...

【专利技术属性】
技术研发人员：常俊义，陈峰，钟迎东，叶朋，侯争平，
申请(专利权)人：内蒙古拜克生物有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15