一种发酵法生产L-茶氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵法生产L‑茶氨酸的方法：将黄色短杆菌接入种子培养基进行扩培，得到种子液1；将硝基还原假单胞菌接入种子培养基进行扩培，得到种子液2；将种子液1和种子液2接入含有抹茶粉的发酵培养基中进行发酵得到发酵液1；向发酵液1中添加乙胺，继续发酵培养得到发酵液2；向发酵液2中添加乙胺，得到发酵液3。本发明专利技术通过联合发酵培养黄色短杆菌和硝基还原假单胞菌，对微生物发酵产生的谷氨酰胺进行直接利用，简化了生产工艺降低了生产成本。本发明专利技术通过在发酵培养基中添加抹茶粉，在发酵的过程中分批次添加乙胺，缩短了发酵时间，提高了L‑茶氨酸的产量。

【技术实现步骤摘要】
一种发酵法生产L-茶氨酸的方法
本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种发酵法生产L-茶氨酸的方法。
技术介绍
L-茶氨酸(N-乙基-γ-谷氨酰胺)是茶叶特有的一种氨基酸，其不参与蛋白质的合成，以游离形式存在，占茶叶中游离氨基酸总量的40％-70％是绿茶中有效的呈味物质，其含量直接决定茶叶的品质。L-茶氨酸具有降血压、抗肿瘤、保护神经、放松、抗抑郁、抗疲劳、提高免疫力、减轻体脂等作用。在医药领域可以用作抗肿瘤药物、降压药物和安神镇静药物，在食品工业中可以作为茶饮料的品质改良剂、改善食品风味的添加剂和功能食品的添加剂。因此，L-茶氨酸成为了茶叶保健成分研究中备受瞩目注目的化合物。L-茶氨酸的制造方法，主要有三种。第一，是直接从茶叶中提取的方法。但由于干茶叶中的L-茶氨酸含量仅有1.5％左右，且光合作用会使L-茶氨酸损失一部分，致使产量很低。随后，便专利技术了适合于工业化生产的第二种方法，即化学有机合成法。但该法可能会残留毒性物质，且生成物包括D、L-型茶氨酸异构体，需要进行拆分才能得到L型产品，使得分离精制操作复杂。第三种制造方法，是利用微生物酶法进行生产。多数是运用微生物产生的酶，以谷氨酰胺和乙胺为前体，合成茶氨酸。目前可以催化L-茶氨酸合成的酶主要有3种：茶氨酸合成酶、谷氨酰胺酶、γ-谷氨酰转肽酶，其中，茶氨酸合成酶是茶叶中的生物合成酶，但是一直以来未能将其基因克隆出来；其他两种酶来自微生物，比较方便进行利用。中国专利公布CN104561160A公开了生物法制备茶氨酸的方法：将硝基还原假单胞菌菌株进行培养得到菌液，对菌液进行过滤得到菌体，将得到的菌体添加到L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐中进行反应，经脱色、膜过滤等步骤得到茶氨酸粉剂或茶氨酸晶体。该工艺酶反应体系里不含有碳源、氮源等培养成分，相对于发酵液而言反应液成分简单，可大幅度提高产品纯度，同时具有酶源与反应液易分离，后处理简单、生产周期短、产量高、环境污染小及成本低等优点。但是，该制备方法需要在反应的过程中同时添加前体物质L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐，这在一定程度上增加了生产成本。中国专利公布CN104830941A公开了一种混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法，该方法采用黄色短杆菌和硝基还原假单胞菌进行混合发酵，发酵结束后将发酵液升温进行菌体灭活处理，然后加入乙胺进行合成转化。该方法利用黄色短杆菌发酵产生谷氨酰胺，硝基还原假单胞菌发酵产生催化酶，并且在不需分离纯化谷氨酰胺的条件下添加乙胺，酶催化生成L-茶氨酸。该方法省略了谷氨酰胺前体的添加，而且直接使用微生物发酵产生的谷氨酰胺，在一定程度上降低了生产成本。但是，该方法生产周期长、L-茶氨酸产量低。所以，目前需要一种生产成本低、生产周期短且L-茶氨酸产量高的生产方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种发酵法生产L-茶氨酸的方法，该方法通过联合发酵培养黄色短杆菌和硝基还原假单胞菌，对微生物发酵产生的谷氨酰胺进行直接利用，酶催化生产L-茶氨酸，该方法生产周期短、L-茶氨酸产量高。说明：1、总接种量是指移入两种种子液的体积之和与接种后培养液体积的比例。本专利技术提供了一种发酵法生产L-茶氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将黄色短杆菌接入种子培养基进行扩培，得到种子液1；(2)将硝基还原假单胞菌接入种子培养基进行扩培，得到种子液2；(3)将种子液1和种子液2接入含有抹茶粉的发酵培养基中进行发酵得到发酵液1；(4)测定发酵液1中谷氨酰胺的含量，按照谷氨酰胺：乙胺＝0.3M:0.05-0.2M的比例向发酵液1中添加乙胺，继续发酵培养得到发酵液2；(5)测定发酵液2中谷氨酰胺的含量，按照谷氨酰胺：乙胺＝0.3M:0.3-1.0M的比例，向发酵液2中添加乙胺，得到发酵液3。所述步骤(1)中的种子培养基包含：葡萄糖20-40g/L、酵母粉2-8g/L、硫酸铵2-8g/L、玉米浆干粉15-25g/L、磷酸二氢钾0.5-3g/L、硫酸镁0.8-1.5g/L；pH为6.9-7.2。所述步骤(1)中接种量以黄色短杆菌菌粉计为0.1g/L。所述步骤(2)中的种子培养基包含：葡萄糖10-20g/L、酵母粉0.5-1.5g/L、谷氨酸钠5-15g/L、硫酸镁0.5-1.5g/L、磷酸二氢钾0.5-1.5g/L、乙二胺四乙酸铁纳0.05-0.2g/L、消泡剂0.1-0.3g/L；pH为6.9-7.3。所述步骤(2)中接种量以硝基还原假单胞菌菌粉计为0.1g/L。所述步骤(3)中接种到发酵培养基中的种子液1和种子液2的体积比为1:0.2-0.5，总接种量为8-12％。所述步骤(3)中发酵培养基含有：酪朊水解物8-15g/L、酵母膏3-8g/L、牛肉膏3-8g/L、葡萄糖18-25g/L、硫酸铵0.5-3g/L、吐温200.5-1.2mL/L、磷酸二氢钾2-10g/L、硫酸镁0.3-0.7g/L、硫酸锰0.1-0.3g/L、硫酸铁0.01-0.05g/L、L-谷氨酸钠18-25g/L、抹茶粉0.1-1.2g/L；pH为6.2-6.8。所述抹茶粉为市售产品或常规方法制品。所述步骤(3)中发酵时间为5-7小时，培养温度为32-35℃，通气量为1.2-2.4V/V·min，搅拌转速为280-450r/min。所述步骤(4)中发酵时间为0.5-2小时，培养温度为32-35℃，通气量为1.2-2.4V/V·min，搅拌转速为280-450r/min。所述步骤(5)中发酵时间为13-16小时，培养温度为32-35℃，通气量为1.2-2.4V/V·min，搅拌转速为280-450r/min。所述方法在L-茶氨酸生产中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)专利技术通过在发酵培养基中添加抹茶粉，提高了L-茶氨酸的产量。(2)本专利技术通过在发酵的过程中分批次添加乙胺，缩短了发酵时间，提高了L-茶氨酸的产量。(3)本专利技术通过联合使用黄色短杆菌和硝基还原假单胞菌，直接使用发酵产生的谷氨酰胺，省略了谷氨氨酰胺的提纯步骤，简化了生产工艺。(4)本专利技术在L-茶氨酸发酵生产过程中，没有对微生物进行灭菌处理，不仅简化了生产步骤，而且缩短了L-茶氨酸的生产时间，提高了生产效率。具体实施方式除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同意义。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的常规技术手段进行。实施例1一种发酵法生产L-茶氨酸的方法(1)将黄色短杆菌接入种子培养基进行扩培，得到种子液1,种子培养基包含：葡萄糖20g/L、酵母粉8g/L、硫酸铵2g/L、玉米浆干粉25g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁1.5g/L，pH为6.9，接种量以黄色短杆菌菌粉计为0.1g/L；(2)将硝基还原假单胞菌接入种子培养基进行扩培，得到种子液2，种子培养基包含：葡萄糖20g/L、酵母粉0.5g/L、谷氨酸钠15g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、乙二胺四乙酸铁纳0.05g/L、消泡剂0.3g/L，pH为6.9，接种量以硝基还原假单胞菌菌粉计为0.1g/L；(3)将种子液1和种子液2接入含有抹茶粉的发酵培养基中进行发酵得到发酵液1，接种到发酵培养基中的种子液1和种子液2的体积比为1:0.2，总接种量为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵法生产L‑茶氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将黄色短杆菌接入种子培养基进行扩培，得到种子液1；(2)将硝基还原假单胞菌接入种子培养基进行扩培，得到种子液2；(3)将种子液1和种子液2接入含有抹茶粉的发酵培养基中进行发酵得到发酵液1；(4)测定发酵液1中谷氨酰胺的含量，按照谷氨酰胺：乙胺＝0.3M:0.05‑0.2M的比例向发酵液1中添加乙胺，继续发酵培养得到发酵液2；(5)测定发酵液2中谷氨酰胺的含量，按照谷氨酰胺：乙胺＝0.3M:0.3‑1.0M的比例，向发酵液2中添加乙胺，得到发酵液3。

【技术特征摘要】
1.一种发酵法生产L-茶氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将黄色短杆菌接入种子培养基进行扩培，得到种子液1；(2)将硝基还原假单胞菌接入种子培养基进行扩培，得到种子液2；(3)将种子液1和种子液2接入含有抹茶粉的发酵培养基中进行发酵得到发酵液1；(4)测定发酵液1中谷氨酰胺的含量，按照谷氨酰胺：乙胺＝0.3M:0.05-0.2M的比例向发酵液1中添加乙胺，继续发酵培养得到发酵液2；(5)测定发酵液2中谷氨酰胺的含量，按照谷氨酰胺：乙胺＝0.3M:0.3-1.0M的比例，向发酵液2中添加乙胺，得到发酵液3。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的种子培养基包含：葡萄糖20-40g/L、酵母粉2-8g/L、硫酸铵2-8g/L、玉米浆干粉15-25g/L、磷酸二氢钾0.5-3g/L、硫酸镁0.8-1.5g/L；pH为6.9-7.2。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中接种量以黄色短杆菌菌粉计为0.1g/L。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的种子培养基包含：葡萄糖10-20g/L、酵母粉0.5-1.5g/L、谷氨酸钠5-15g/L、硫酸镁0.5-1.5g/L、磷酸二氢钾0.5-1.5g/L、乙二胺四乙酸铁纳0.05-0.2g/L、消泡剂0.1-0.3g/L；pH为6.9-7....

【专利技术属性】
技术研发人员：宋春慧，陈峰，郑国强，刘培，马光辉，
申请(专利权)人：内蒙古拜克生物有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15