一种酶法拆分手性物质的方法技术

本发明专利技术属于生物工程与食品技术领域，公开了一种酶法拆分手性物质的方法，包括以下步骤：(1)配置脂肪酶浓度为1‑3000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性盐、亲水性溶剂和疏水性溶剂，配成三液相体系；所述疏水性溶剂中含有消旋型手性物构成的酯类或酰胺类化合物；(2)将三液相体系于搅拌条件下进行酶催化反应，反应结束后，静置或离心至分为三层，从上自下依次为上液层、中液层和下液层，水解后的单一旋光手性产物主要富集于中液层或下液层，上液层产物为另一含单一旋光手性产物的酯类或酰胺类产品。该方法具有能耗小、原料利用率高、反应条件温和等优点，解决了现有酶法手性拆分效率低、手性选择性差、回收率低、难于工业化的难题。

【技术实现步骤摘要】
一种酶法拆分手性物质的方法
本专利技术属于生物工程与食品
，涉及到酶的分离与应用技术，特别涉及到利用酶法拆分手性物质的方法。
技术介绍
近几十年，手性物质开发处于井喷发展期，世界上正在开发的药物中，三分之二以上是手性药物，目前其市场规模已超过2500亿美金。而以药效更高、副作用更小的单一手性药物取代传统混合消旋体药物已成为发展的必然趋势。我国虽然在手性物质上拥有大量的需求缺口和相关的基础资源，但由于技术落后，产品质量差等问题导致绝大部分相关产品难于与西方国家竞争，亟需产业升级。目前单一构型异构体的制备主要通过诱导结晶或化学拆分法等方法对外消旋体的拆分，传统工艺通常采用手性拆分剂拆分，效率低，要经过多次反复精制才能达到标准。导致整个过程工艺极端复杂，成本极高等难题(J.Mol.Catal.B:Enzym.,2010,62(2):162-168,Org.Biomol.Chem.,2014,12,6634-6642,J.Mol.Catal.B:Enzym.,2010,65(1/4):49-51)。而酶法拆分具有条件温和、产品纯度高等优点，被寄予厚望，但是，一方面，手性产物与其对映体副产物的理化性质过于接近，使其难于通过常规分离手段将产物与副产物同步分离，来提高反应选择性。通过加入手性选择剂的萃取拆分虽有一定潜力，但脂肪酶催化属于界面催化，即使在双相体系中，其产物也会对反应具有较强的抑制作用，因而，难于利用现有体系解除产物抑制以提高催化效率。另一方面，手性拆分对产物的光学纯度要求又极高，通常情况下，单旋光性产物的纯度通常要大于99％，随着反应进行，目标底物含量逐渐降低，产物逐渐积累，导致大部分反应副反应多、产物纯度低、转化率差等难题，因此仅在少数反应具有高选择性的酶(通常E≥100)才有工业化潜力，这就极大地加大了其研发难度(Tetrahedron2007,63:1721–1754)。另外，传统酶催化体系还存在控制困难，产物分离及酶的回用往往难于兼容等难题，严重制约了其发展。因此亟需开发高效、可控的催化及分离体系，以适用其发展(JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic,2012,4:78-82，Tetrahedron2007,63:1721–1754)。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前酶法拆分生产手性物质过程中，存在的成本高，连续化生产困难，产物抑制带来的反应效率低、反应时间长等问题，提供了一种高效快速的酶法拆分生产手性物质的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种酶法拆分手性物质的方法，包括以下步骤：(1)配置脂肪酶浓度为1-3000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性盐、亲水性溶剂和疏水性溶剂，配成三液相体系；所述可溶性盐、亲水性溶剂和疏水性溶剂与酶液的质量比分别为0.1-0.9、0.1-5和0.1-10；所述疏水性溶剂中含有消旋型手性物构成的酯类或酰胺类化合物；(2)将三液相体系于搅拌条件下进行酶催化反应，反应结束后，静置或离心至分为三层，从上自下依次为上液层、中液层和下液层，水解后的单一旋光手性产物主要富集于中液层或下液层，上液层产物为另一含单一旋光手性产物的酯类或酰胺类产品。优选地，步骤(1)所述亲水性溶剂为聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇和丙酮中的一种或两种以上；或者所述亲水性溶剂为[BMIM]Br、[BMIM]BF4、[EMIM]ETSO4和[OMIM]Cl中的一种或两种以上。优选地，步骤(1)所述可溶性盐是柠檬酸钠、氯化钠、硫酸铵、碳酸钠、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或两种以上。优选地，步骤(1)所述疏水性溶剂是正己烷、乙醚、异丙醚、乙酸乙酯、环己醇、石油醚、异辛烷、苯和甲苯中的一种或两种以上。优选地，步骤(2)的反应条件为：温度30～45℃，反应时间为20min～4h。反应操作一般在低于溶剂易挥发的温度下进行。为了使手性产物的脱除和改性效果尽可能达到最佳，可以调节体系的pH值。优选地，步骤(1)所述三液相体系的pH值为5-9。优选地，步骤(1)所述脂肪酶浓度为5-2000U/mL。优选地，所述可溶性盐、亲水性溶剂和疏水性溶剂与酶液质量比分别为0.2-0.8、0.2-0.8和0.2-4。优选地，所述消旋型手性物构成的酯类或酰胺类化合物选自混旋型扁桃酸甲酯、混旋型萘普生甲酯、混旋型(4-甲氧基-苯基)-1-乙醇乙酸酯、混旋型1-(4-甲氧基苯基)乙醇乙酸酯、混旋型6-甲基5-庚烯基2-醇乙酸酯中的任意一种或两种以上。优选地，所述消旋型手性物构成的酯类或酰胺类化合物占疏水性溶剂质量的0.1-10％，，优选1％～5％。上述脂肪酶催化反应中，脂肪酶可以来自天然，也可以通过人工发酵产生。可以是发酵液，可以是经简单纯化后的粗酶，也可是经纯化后纯酶。本专利技术的有益效果如下：本专利技术克服了目前酶法拆分并同步回收手性物质过程中，存在的成本高，连续化生产困难，产物抑制带来的反应效率低、反应时间长等难题，提供了一种从粗酶液中分离脂肪酶以及利用脂肪酶拆分生产手性物质的方法。使工艺得以简化，分离时间短，成本降低，经济可行。具体表现在：利用三液相体系可将一种单一旋光手性产物的酯类或酰胺类底物分配在疏水相，脂肪酶分配在富溶剂相或富盐相，水解后的单一旋光手性产物主要富集于另一相，经简单离心或静置等方式即可将产物回收利用。该过程既有利于酶的纯化与回收，也有提高催化效率，大幅降低酶的损耗与纯化成本。该方法具有能耗小、原料利用率高、反应条件温和等优点，解决了现有酶法拆分生产手性物质难于工业化的技术难题。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步具体详细描述，但本专利技术的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。本实施例中本实施例中所用CALB(CandidaantarcticalipaseB)，Novozyme-51032(cutinase)脂肪酶购于Novozyme公司，脂肪酶AY30(Candidarugosalipases)购于日本天野公司。实施例1取适量CALB脂肪酶置于锥形瓶中，加入1000倍体积的水，混匀后，取1g粗酶液(酶浓度5U/mL)，0.6g的磷酸氢二钾，混匀后加入0.4g聚乙二醇400和0.4g含5％混旋型扁桃酸甲酯的异丙醚溶液，装入具塞三角瓶中混合均匀，混合溶液的pH值为8.9，并置于转速为200rpm的恒温摇床上，控制在30℃下反应2h。另取1g粗酶液(5U/mL)，加入0.4g含5％混旋型扁桃酸甲酯的异丙醚溶液，并用水稀释至相同体积，在相同条件下反应作为对照。反应结束后，设定5000rpm转速离心5min，分为三层，依次为上液层、中液层和下液层，水解后的单一旋光手性产物主要富集于中液层或下液层，收集上液层产物即为另一单一旋光手性产物的酯类或酰胺类产品。脂肪酶主要分配于中液层，中下液层的分配系数可达4.75。另取中下液层测量其酶活和上液层扁桃酸甲酯的旋光度，可得疏水相中S-扁桃酸甲酯的旋光度达到了99.5％，而对照组仅分为上下两相，产物两相均有分布，S-扁桃酸甲酯总的旋光度仅为43％。实施例2取适量脂肪酶AY30置于锥形瓶中，加入100倍体积的水，混匀后，取0.975g粗酶液(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶法拆分手性物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配置脂肪酶浓度为1‑3000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性盐、亲水性溶剂和疏水性溶剂，配成三液相体系；所述可溶性盐、亲水性溶剂和疏水性溶剂与酶液的质量比分别为0.1‑0.9、0.1‑5和0.1‑10；所述疏水性溶剂中含有消旋型手性物构成的酯类或酰胺类化合物；(2)将三液相体系于搅拌条件下进行酶催化反应，反应结束后，静置或离心至分为三层，从上自下依次为上液层、中液层和下液层，水解后的单一旋光手性产物主要富集于中液层或下液层，上液层产物为另一含单一旋光手性产物的酯类或酰胺类产品。

【技术特征摘要】
1.一种酶法拆分手性物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配置脂肪酶浓度为1-3000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性盐、亲水性溶剂和疏水性溶剂，配成三液相体系；所述可溶性盐、亲水性溶剂和疏水性溶剂与酶液的质量比分别为0.1-0.9、0.1-5和0.1-10；所述疏水性溶剂中含有消旋型手性物构成的酯类或酰胺类化合物；(2)将三液相体系于搅拌条件下进行酶催化反应，反应结束后，静置或离心至分为三层，从上自下依次为上液层、中液层和下液层，水解后的单一旋光手性产物主要富集于中液层或下液层，上液层产物为另一含单一旋光手性产物的酯类或酰胺类产品。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述亲水性溶剂为聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇和丙酮中的一种或两种以上；或者所述亲水性溶剂为[BMIM]Br、[BMIM]BF4、[EMIM]ETSO4和[OMIM]Cl中的一种或两种以上。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述可溶性盐是柠檬酸钠、氯化钠、硫酸铵、碳酸钠、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或两种以上。4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志刚，苏金芬，杨博，王永华，李振成，陈华勇，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44