冠状病毒抗性克隆猪及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪及其制备方法，该克隆猪的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获取特异性靶向pAPN基因第2外显子和第3外显子的gRNA序列，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.1‑2所示；制备获得对应gRNA序列的CRISPR‑Cas9打靶载体PX330‑pAPN2和PX330‑pAPN3；(2)将获得的打靶载体PX330‑pAPN2或打靶载体PX330‑pAPN3转入猪胎儿成纤维细胞中，获得pAPN基因编辑细胞系；(3)对pAPN基因编辑细胞系进行体细胞核移植操作，并将重构胚胎移植入代孕受体，通过自然妊娠出生所述克隆猪。本发明专利技术可获得猪冠状病毒受体pAPN完全缺失表达的克隆猪，具有抵抗猪冠状病毒感染的能力。

【技术实现步骤摘要】
冠状病毒抗性克隆猪及其制备方法
本专利技术涉及基因技术，特别涉及一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪及其制备方法。
技术介绍
CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/CRISPR-associatedprotein(Cas)9系统是原核生物的一种适应性免疫系统，用来抵御噬菌体及外源遗传物质侵入。近年来，研究者通过改造该系统使其可适用于哺乳动物的细胞与体内。该系统通过一条与目的DNA位点序列一致的guideRNA(gRNA)进行引导，从而介导Cas9蛋白对目的位点进行特异性地切割，从而形成DNA双链断裂。而基因组上的双链断裂可以显著提升后续的基因敲除(Knockout)和基因敲入(Knockin)的效率，从而可以高效地对目的位点进行修饰操作，从而达到缺失目的基因表达表达，或赋予目的基因以新的功能。CRISPR/Cas9当前已在生物、医学、农业等各个领域都得到了广泛而深入的应用，几乎可以对任何物种的任意基因片段进行随心所欲的编辑。冠状病毒(Coronavirus)是一类影响养猪业的重要病毒，主要引起猪腹泻和呼吸系统疾病，尤其对仔猪具有较高致死率。当前主要流行的猪冠状病毒包括流行性肠胃炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)、猪呼吸道冠状病毒(porcinerespiratorycoronavirus，PRCV)和丁型冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus，PDCoV)等。这其中尤以PEDV最为严重，其近年来广泛流行、常态爆发，对哺乳期仔猪的致死率可达95％以上，给养猪业造成重大经济损失。此类病毒的疫苗防控较为困难，对仔猪的被动乳汁免疫是主要途径，其防控效果尚不够明确；且毒株变异的加快也造成疫苗防控的滞后与无效。前期的研究发现猪氨肽酶N(PigAminopeptidaseN，pAPN)是多种冠状病毒的细胞受体，包括TGEV、PRCV、PDCoV等，PEDV感染宿主的受体也可能为pAPN，但尚存在争议。细胞水平的研究发现冠状病毒非敏感细胞导入表达pAPN后可以变为冠状病毒的敏感细胞；而阻断冠状病毒与pAPN的结合可以抑制其对宿主细胞的感染。因此如能缺失猪体内pAPN基因的表达，将会阻断多种冠状病毒对猪的感染。培育该种受体缺失猪对养猪业具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪，通过将猪冠状病毒受体pAPN基因敲除，完全缺失猪体内pAPN蛋白的表达，从而具有抵抗猪冠状病毒感染的能力；基于上述，本专利技术还提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，利用CRISPR/Cas9系统介导的定点打靶技术对pAPN基因进行移码突变，从而获得pAPN基因敲除的克隆猪。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，包括以下步骤：(1)获取特异性靶向pAPN基因第2外显子和第3外显子的gRNA序列，其核苷酸序列依次如SEQIDNo.1-2所示；制备获得对应gRNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体，所述CRISPR/Cas9打靶载体的制备方法为：将PX330载体用限制性内切酶BbsI进行酶切；分别合成第2外显子和第3外显子的gRNA正链和互补链DNA，并在两端带上与酶切后的PX330载体形成的黏性末端相匹配的序列；将第2外显子和第3外显子的gRNA正链与其互补链DNA分别混合，然后将混合后的混合序列置于温度至少为98-100℃的水中煮沸2.5-3.5min，然后静置冷却至20-30℃，使得两条互补链DNA退火形成双链DNA，并携带可与由BbsI酶切后的PX330载体相连接的黏性末端；退火形成的双链DNA与由BbsI酶切后的PX330载体连接；获得打靶载体PX330-pAPN2和打靶载体PX330-pAPN3；(2)将获得的打靶载体PX330-pAPN2或打靶载体PX330-pAPN3转入猪胎儿成纤维细胞中，经单克隆化及筛选获得pAPN敲除的阳性细胞克隆；(3)以阳性细胞为核供体，植入去核猪卵母细胞中，获得阳性重构猪胚胎；再将重构猪胚胎植入代孕母猪子宫内妊娠，获得所述克隆猪。一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪，采用上述的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法获得。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，采用靶向猪pAPN基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体转入猪胎儿成纤维细胞中，获得pAPN打靶的阳性细胞克隆，阳性克隆中pAPN的第2或第3外显子中被引入移码突变，导致pAPN蛋白无法表达；以pAPN打靶的阳性克隆为核移植供体细胞，通过体细胞核移植技术获得重构克隆猪胚胎；将胚胎移植如代孕母猪子宫内经妊娠获得pAPN缺失的克隆猪。本专利技术可获得多种猪冠状病毒受体pAPN完全缺失表达的克隆猪，制备的克隆猪无pAPN蛋白表达，具有抵抗猪冠状病毒感染的能力。附图说明图1为本专利技术实施例1中pAPN基因结构与选取的打靶位点信息图；图2为本专利技术实施例3中克隆猪的照片；图3为本专利技术实施例3中出生克隆猪以及野生型对照猪的pAPN蛋白表达检测对比图。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本专利技术最关键的构思在于：利用CRISPR/Cas9基因编辑系统在猪体细胞的pAPN基因的第2或第3外显子中引入移码突变，导致pAPN蛋白无法表达；再通过体细胞核移植获得缺失pAPN表达的克隆猪。一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，包括以下步骤：(1)获取特异性靶向pAPN基因第2外显子和第3外显子的gRNA序列，其核苷酸序列依次如SEQIDNo.1-2所示；制备获得对应gRNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体，所述CRISPR/Cas9打靶载体的制备方法为：将PX330载体用限制性内切酶BbsI进行酶切；分别合成第2外显子和第3外显子的gRNA正链和互补链DNA，并在两端带上与酶切后的PX330载体形成的黏性末端相匹配的序列；将第2外显子和第3外显子的gRNA正链与其互补链DNA分别混合，然后将混合后的混合序列置于温度至少为98-100℃的水中煮沸2.5-3.5min，然后静置冷却至20-30℃，使得两条互补链DNA退火形成双链DNA，并携带可与由BbsI酶切后的PX330载体相连接的黏性末端；退火形成的双链DNA与由BbsI酶切后的PX330载体连接；获得打靶载体PX330-pAPN2和打靶载体PX330-pAPN3；(2)将获得的打靶载体PX330-pAPN2或打靶载体PX330-pAPN3转入猪胎儿成纤维细胞中，经单克隆化及筛选获得pAPN敲除的阳性克隆；(3)以阳性细胞为核供体，植入去核猪卵母细胞中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获取特异性靶向pAPN基因第2外显子和第3外显子的gRNA序列，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.1‑2所示；制备获得对应gRNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体，所述CRISPR/Cas9打靶载体的制备方法为：将PX330载体用限制性内切酶BbsI进行酶切；分别合成第2外显子和第3外显子的gRNA正链和互补链DNA，并在两端带上与酶切后的PX330载体形成的黏性末端相匹配的序列；将第2外显子和第3外显子的gRNA正链与其互补链DNA分别混合，然后将混合后的混合序列置于温度至少为98‑100℃的水中煮沸2.5‑3.5min，然后静置冷却至20‑30℃，使得两条互补链DNA退火形成双链DNA，并携带可与由BbsI酶切后的PX330载体相连接的黏性末端；退火形成的双链DNA与由BbsI酶切后的PX330载体连接；获得打靶载体PX330‑pAPN2和打靶载体PX330‑pAPN3；(2)将获得的打靶载体PX330‑pAPN2或打靶载体PX330‑pAPN3转入猪胎儿成纤维细胞中，经单克隆化及筛选获得双等位pAPN敲除的阳性克隆；(3)以阳性细胞为核供体，植入去核猪卵母细胞中，获得阳性重构猪胚胎；再将重构猪胚胎植入代孕母猪子宫内妊娠，获得所述克隆猪。...

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获取特异性靶向pAPN基因第2外显子和第3外显子的gRNA序列，其核苷酸序列依次如SEQIDNo.1-2所示；制备获得对应gRNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体，所述CRISPR/Cas9打靶载体的制备方法为：将PX330载体用限制性内切酶BbsI进行酶切；分别合成第2外显子和第3外显子的gRNA正链和互补链DNA，并在两端带上与酶切后的PX330载体形成的黏性末端相匹配的序列；将第2外显子和第3外显子的gRNA正链与其互补链DNA分别混合，然后将混合后的混合序列置于温度至少为98-100℃的水中煮沸2.5-3.5min，然后静置冷却至20-30℃，使得两条互补链DNA退火形成双链DNA，并携带可与由BbsI酶切后的PX330载体相连接的黏性末端；退火形成的双链DNA与由BbsI酶切后的PX330载体连接；获得打靶载体PX330-pAPN2和打靶载体PX330-pAPN3；(2)将获得的打靶载体PX330-pAPN2或打靶载体PX330-pAPN3转入猪胎儿成纤维细胞中，经单克隆化及筛选获得双等位pAPN敲除的阳性克隆；(3)以阳性细胞为核供体，植入去核猪卵母细胞中，获得阳性重构猪胚胎；再将重构猪胚胎植入代孕母猪子宫内妊娠，获得所述克隆猪。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，其特征在于，打靶识别位点SEQIDNo.1和SEQIDNo.2位于基因编码区的ATG下游的最开始的1-2个外显子上。3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，其特征在于，选用CRISPR骨架载体PX330，并将基因编辑位点序列构入骨架载体获得pAPN特异的CRISPR打靶载体P...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨化强，张健，石俊松，吴珍芳，
申请(专利权)人：华南农业大学，温氏食品集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44