一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统技术方案

技术编号:20884718 阅读:45 留言:0更新日期:2019-04-17 13:31
本发明专利技术提供了一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统,其特征在于,该系统包括在CRISPR/Cas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA,所述sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′‑G(21N)NNGRRT‑3或者5′‑ARRCNN(21N)C‑3′的序列排列规则,所述靶向敲除TCR基因的靶序列以病毒为转染载体,其中5′端和3′端带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因可以通过所述的病毒为载体,使用时与含有TCR基因的靶序列的病毒共同转染细胞,或把TCR基因的靶序列、Cas9、5′端和3′端都带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因,三者一起包装到杆状病毒中,以杆状病毒为载体转染细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统
本专利技术涉及基因靶向编辑领域,尤其涉及一种利用基因编辑技术制备可异体移植T细胞技术,具体的为一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统。
技术介绍
近年来,利用免疫疗法来治疗肿瘤,受到广泛的关注。在众多的免疫疗法中,基于嵌合抗原受体T细胞(ChimericantigenreceptorTcells,CAR-T)疗法,效果最为显著和成熟。目前已经有多例临床试验证明,该技术可以治愈多种肿瘤,例如B细胞肿瘤。其基本原理是利用基因工程的方法,将能识特异识别肿瘤细胞的受体基因,利用整合型病毒作为载体,将该受体基因整合到患者T细胞基因组中,从而使改造后的T细胞具有特异性识别和杀伤肿瘤细胞的目的,从而达到治疗肿瘤的效果。另一方面,该技术还存在一些急需解决的障碍,首先,该技术只能针对病人自体T细胞进行编辑,大大提高了其治疗成本及延长治疗周期(利用病人自身T细胞制备CAR-T细胞,一般耗时长);第二,由于T细胞表面不仅表达CAR还有自身的TCR受体表达,研究发现TCR受体会影响CAR受体的功能,有临床研究表面,可对神经系统造成伤害,形成脑水肿。为解决以上CAR-T治疗技术的问题,多个研究小组利用基因编辑技术(ZFN,TALEN)针对TCR受体敲除,取得了显著效果。有研究报道,目前利用TALEN技术敲除TCR受体来制备MCAR-T技术(MniversaICAR-T),该技术一方面将TCR受体通过TALEN定点敲除,另一方面通过同源重组技术将CAR基因定点整合到TCR基因位点。该技术不仅有效的避免了异体移植导致的移植物抗宿主反应GVHD(GhostVersμsHostDisease),使得CAR-T细胞的制备摆脱个性化的缺陷而进入到标准化和规模化的时代,同时还避免了TCR基因对CAR受体功能的干扰。此外,由于CAR基因定点整合到TCR位点上,避免了现行CAR-T制备中CAR基因随机整合基因组所导致的潜在癌变风险。目前该技术已经获得了FDA的临床试验批文,而且利用该技术成功为两患者进行了治疗。然而由于ZFN或者TALEN技术属于第一,二代基因编辑技术,在应用方面存在很大的局限性,例如构建流程复杂、周期长、成本高等。近几年基因编辑技术突破性的发展,利用现在的编辑手段,可以将目的基因进行精准编辑。尤其是第三代基因编辑技术CRISPR具有明显的优势,例如构建简单,效率高,成本低等。CRISPR系统均包含以下几个部分:1)PAM位点,位于靶序列的下游,只有几个nt(例如,SpCAS9/NGG;SaCAS9/NNGRRT),根据此位点来选取靶序列;2)靶序列(sgRNA),识别并与切割位点结合的序列,一般在20nt左右;3)TracRNA,连接于靶序列之后的一段回文RNA序列;4)Cas9内切酶,具有独立酶活性,Cas9含有在氨基末端的RμvC和蛋白质中部的HNH2个独特的活性位点,Cas9中的HNH活性位点剪切sgRNA的互补DNA链,RμvC活性位点剪切非互补链。其工作原理为:sgRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体,识别并结合于sgRNA互补的序列,然后解开DNA双链,形成R-loop,使sgRNA与互补链杂交,另一条链保持游离的单链状态,然后由Cas9中的HNH活性位点剪切sgRNA的互补DNA链,RμvC活性位点剪切非互补链,最终引入DNA双链断裂(DSB)。CRISPR技术目前已经广泛应用于多个领域,例如动植物育种,疾病治疗,以及基础科研等领域。CRISPR-SACAS9系统,是一种来自金黄色葡萄球菌的CAS9酶。其在哺乳动物细胞中的基因编辑效率高,而且其基因比较小(3.1kb)。因此,该系统能够利用多种转染系统转染,例如电转化、腺相关病毒等。另外由于SACAS9系统PAM序列较长(NNGRRT),且靶点识别序列在21-23nt,导致该系统具有靶向性高、脱靶效率低等优点。鉴于现有CAR-T技术还有待进一步完善和优化,以及CRISPR/SACAS9技术在基因精准编辑上等高效性和安全性,本专利技术将二者有机结合,用CRISPR/SACAS9技术敲除人TCR基因,制备可异体移植的通用型T细胞,用以改善和优化CAR-T制备技术。CRISPR/Cas9介导的定点同源重组必备两个条件:一是CRISPR/Cas9,含有效切割目的基因的gRNA;二是同源重组供体(图1),一般含上、下游同源臂,以及在两同源臂之间的需要定点整合的外源DNA序列(该外源序列可以含启动子或不含启动子,如不含启动子,则必须插入外显子序列并保持插入后读码框正确)。当宿主的基因组DNA被gRNA识别并引导Cas9定点切割,同源重组供体存在下,宿主细胞倾向于通过同源重组的方式修复基因组DNA,从而在基因组DNA特定位点引入了外源DNA序列(图2)。经我们研究发现,同源臂序列的长度,以及外源DNA序列的长度,对重组效率都有极大影响。目前我们确定最优的同源臂长度在800bp以内(含800bp),而外源DNA序列长度以5kb以内为佳。采用CRISPR/Cas9介导的定点同源重组技术,在敲除人TCR基因的同时,在TCR基因特定位点(Cas9切割位点),通过同源重组技术插入嵌合抗原受体(CAR)基因,从而达到TCR敲除和CAR表达的双重效果。利用该技术可以制备特异性攻击肿瘤组织的通用型T细胞,这种通用型T细胞具有以下几方面的优点:1)敲除了TCR基因,避免了异体移植导致的移植物抗宿主反应,所以利用该技术可以实现T细胞的异体移植,实现CAR-T的标准化和规模化生产,降低成本并缩短生产周期;2)TCR基因敲除减低TCR对细胞表面CAR功能的影响,降低临床安全风险;3)CAR定点插入TCR位点,达到TCR敲除和CAR表达的双重效果,避免现有技术中心CAR随机插入带来的癌变风险。
技术实现思路
本专利技术的目的在于,提供一种能够异体移植的通用型T细胞制备技术,该技术制备的T细胞具备以下优点:第一,能够异体移植,使用于制备CAR-T的T细胞成为一种储备型生物药品,便于大规模、批量化、标准化生产;第二,提高CAR受体的功能活性,避免了TCR受体的干扰。同时,利用CRISPR/Cas9介导的TCR基因位点定点同源重组技术,该技术制备的T细胞具备以下优点:第一,TCR基因敲除,可以异体移植,规模化生产;第二,避免TCR受体干扰CAR受体的功能;第三,TCR基因位点定点插入外源基因,可实现CAR基因定点整合到TCR基因位点,避免异体移植导致的移植物抗宿主反应。本专利技术提供一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统,该系统包括在CRISPR/SaCas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA,以及5′端和3′端带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因。该系统通过六型腺相关病毒(AAV6)或慢病毒或杆状病毒为载体转染细胞。本专利技术的技术方案如下:一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统,该系统包括在CRISPR/Cas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA,所述sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′-G(21N)NNGRRT-3或者5′-ARRCNN(21N)C-3′的序列排列规则,所述系统还包括5′端和3本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统,其特征在于,该系统包括在CRISPR/Cas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA,所述sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′‑G(21N)NNGRRT‑3或者5′‑ARRCNN(21N)C‑3′的序列排列规则,所述系统还包括5′端和3′端带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因。

【技术特征摘要】
1.一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统,其特征在于,该系统包括在CRISPR/Cas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA,所述sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′-G(21N)NNGRRT-3或者5′-ARRCNN(21N)C-3′的序列排列规则,所述系统还包括5′端和3′端带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因。2.一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统,其特征在于,该系统包括在CRISPR/Cas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA,所述sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′-G(21N)NNGRRT-3或者5′-ARRCNN(21N)C-3′的序列排列规则,靶向敲除TCR基因的靶序列以病毒为转染载体,所述系统还包括5′端和3′端带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因,其可以通过所述的病毒为载体,使用时与含有TCR基因的靶序列的病毒共同转染细胞。3.一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统,其特征在于,该系统包括在CRISPR/Cas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA,所述sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′-G(21N)NNGRRT-3或者5′-ARRCNN(21N)C-3′的序列排列规则,所述系统还包括5′端和3′端带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因,使用时把TCR基因的靶序列、Cas9基因、5′端和3′端都带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因,三者一起包装到杆状病毒中,以杆状病毒为载体转染细胞。4.根据权利要求1或2或3所述的用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统,其特征在于,还包括以所述人TCR基因α链和β链恒定区作为靶标,通过靶向TCR基因α链和β链的sgRNA筛选,由此获得了在CRISPR-Cas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA,所述人TCR基因α链和β链恒定区基因号为NC_000014.9;NC_000007.14。5.根据权利要求1或2或3所述的用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统,其特征在于,还包括以所述人TCR基因α链和β链恒定区作为靶标,依据SACAS9F.AnnRanetal.2015编辑规则筛选出了多个靶序列,其中21N的靶序列如SEQIDNO:1~SEQIDNO:30中任意一条序列。6.根据权利要求1或2或3所述的用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统,其特征在于,还包括sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′-G(20N)NGG-3′或者5′-CCN(20N)C-3′的序列排列规则...

【专利技术属性】
技术研发人员:祝海宝黄雨亭陈梓珊罗思施陶米林梁福才
申请(专利权)人:广东赤萌医疗科技有限公司
类型:发明
国别省市:广东,44

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