本发明专利技术属于医药生物领域，具体涉及联合MSLN单链抗体和PD‑1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用。该CAR载体包括MSLN单链抗体和PD‑1mAb，CAR结构为CD8leader‑MSLN scfv‑CD8α‑CD28‑CD137‑CD3ζ‑IRES‑PD‑1mAb，以病毒感染方式获得CAR‑T细胞(Chimeric Antigen Receptor T‑Cell)，通过表达CAR结构，靶向识别和杀伤MSLN阳性表达的胃癌细胞。PD‑1mAb与T细胞表面的PD‑1结合，阻断PD‑1和PD‑L1的结合，从而上调T细胞的生长和增殖，使CAR‑T细胞表现出更强的肿瘤细胞杀伤能力。
【技术实现步骤摘要】
联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用
本专利技术属于医药生物领域，具体涉及联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用。
技术介绍
胃癌是我国目前临床比较常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率和高死亡率的特点，在我国，胃癌的发病率和死亡率占恶性肿瘤的第三位。目前，胃癌的治疗方式主要有手术治疗、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗。手术是唯一可能治愈胃癌的方式，但进展期胃癌的单纯手术治疗可能会存在肉眼或镜下残留灶，使复发转移率大大增加；放化疗毒副作用大，疗效也不能达到满意效果；因此新的治疗方法亟待提出。LAK细胞、DC、CIK细胞都曾作为肿瘤的免疫治疗手段，但是以上各种治疗方法均缺乏特异性识别肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen，TAA)和杀伤特定肿瘤靶细胞的能力；而肿瘤免疫编辑的过程又会使靶细胞表面的主要组织相容性复合物(mainhistocompatibilitycomplex，MHC)在肿瘤细胞表面表达下降，形成免疫逃逸，使肿瘤细胞可成功躲避T细胞攻击。嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人为过表达能识别特定的肿瘤表面抗原的单链抗体可变区基因片段，从而使T细胞识别特定抗原、杀伤表达该抗原的靶细胞。同时，由于CAR-T细胞是采用抗体识别抗原模式，因此不受MHC的限制。间皮素(MSLN)是一种存在于细胞表面的锚定糖蛋白，因其在正常组织中不表达或间皮组织中低表达，但在30％的肿瘤中高表达，如卵巢癌、胃癌、结肠癌等实体瘤，而成为备受关注的肿瘤细胞特异性靶向抗原。PD-1(Programmedcelldeathprotein1)程序性细胞死亡受体1，是属于免疫球蛋白超家族的细胞表面受体，在T细胞和前B细胞上表达。通过下调免疫系统并促进自身耐受在调节免疫系统对人体细胞的应答方面起作用，预防自身免疫性疾病。PD-L1(programmeddeathligand1)是PD-1的配体，与T细胞上的PD-1结合后，可抑制T细胞增殖和活化，使T细胞处于失活状态。研究发现，多种肿瘤细胞中PD-L1均有上调表达，因此促进了肿瘤免疫逃逸。PD-1单克隆抗体(PD-1mAb)可与T细胞表面的PD-1结合，阻断PD-1和PD-L1的结合，从而上调T细胞的生长和增殖，增强T细胞对肿瘤细胞的识别，激活其攻击和杀伤功能，通过调动人体自身的免疫功能实现抗肿瘤作用。
技术实现思路
本专利技术目的是为了解决上述问题，本专利技术提供了能靶向MSLN并联合PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体。本专利技术针对胃癌细胞特异性蛋白MSLN，有效避免肿瘤免疫逃逸；通过PD-1mAb阻断PD-1和PD-L1的结合，从而提高CAR-T免疫疗法抗胃癌的效果。此外，还包括联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的构建方法及其应用。本专利技术提供的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体具体技术方案如下：联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，包括嵌合抗原受体和载体，所述嵌合抗原受体连接在所述载体上，所述嵌合抗原受体包括两种特异性结构分别为：MSLN单链抗体和PD-1mAb，所述MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述PD-1mAb的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的结构组成为CD8leader-MSLNscFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ-IRES-PD-1mAb。在某些实施方式中，所述CD8leader可表达引导新合成的蛋白质进行跨膜转移的引导肽，所述CD8leader的核苷酸序列SEQIDNO.1所示，所述MSLNscFv表示MSLN单链抗体，所述CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，且核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述CD28-CD137为共刺激结构域，所述CD28核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述CD137核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述CD3ζ为信号转导域，核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述IRES为核糖体识别位点，是实现同一载体高效共表达两个基因的元件，核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。在某些实施方式中，所述载体包括PUC19质粒和慢病毒载体，所述慢病毒载体插入所述PUC19质粒上。在某些实施方式中，所述慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。本专利技术还提供了构建上述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的方法，步骤如下：(1)将所述嵌合抗原受体保存在所述PUC19质粒上；(2)将含有步骤(1)中PUC19质粒和所述慢病毒载体进行双酶切，将酶切产物分别经过琼脂糖凝胶电泳分离，获得双酶切后的含有所述嵌合抗原受体的目的片段和双酶切后慢病毒载体，(3)将步骤(2)中的含有所述嵌合抗原受体的目的片段和步骤(2)中的慢病毒载体进行连接，将连接产物进行转化，提取质粒，获得含有嵌合抗原受体结构的重组质粒，所述重组质粒为联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体。在某些实施方式中，所述步骤(2)中的双酶切为EcoRI和NotI，所述(3)中含有所述嵌合抗原受体的目的片段和慢病毒载体连接的摩尔比为5:1。本专利技术还提供了联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的应用，将所述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体进行慢病毒包装，经离心浓缩后获得高滴度的慢病毒悬液，所述慢病毒悬液用于感染T细胞，获得CAR-T细胞，所述CAR-T细胞通过识别特异性蛋白MSLN和PD-1靶向杀伤胃癌细胞。在某些实施方式中，所述慢病毒包装采用三质粒包装系统，所述三质粒包装系统包括PSPAX2质粒、pMD2G质粒和所述联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，所述PSPAX2质粒、所述pMD2G质粒、所述联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的比例为27:3:20，所述慢病毒包装采用293T细胞作为慢病毒的包装细胞。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术针对治疗载体的CAR结构包括MSLN单链抗体、PD-1mAb两个特异性结构；MSLN单链抗体是根据多种胃癌细胞表面会表达肿瘤相关抗原MSLN确定的特异性结构，该结构表达的Anti-MSLN特异性蛋白负责识别TAA，一方面可靶向性杀伤肿瘤细胞；另一方面，抗体Anti-PD-1可与T细胞表面的PD-1结合，阻断PD-1和PD-L1的结合，从而下调了PD-1对T细胞的影响，增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，同时，增强人体自身的免疫功能实现抗肿瘤作用。当T细胞通过病毒感染方式获得该载体并表达该CAR结构后，T细胞即可靶向性识别并杀伤胃癌细胞。附图说明图1是本专利技术的慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro结构示意图；图2是本专利技术的CAR结构示意图；图3是本专利技术的慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-PuroEcoRI与NotI双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；图4是本专利技术的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体E本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.联合MSLN单链抗体和PD‑1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，包括嵌合抗原受体和载体，所述嵌合抗原受体连接在所述载体上，所述嵌合抗原受体包括两种特异性结构分别为：MSLN单链抗体和PD‑1mAb，所述MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述PD‑1mAb的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
【技术特征摘要】
1.联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，包括嵌合抗原受体和载体，所述嵌合抗原受体连接在所述载体上，所述嵌合抗原受体包括两种特异性结构分别为：MSLN单链抗体和PD-1mAb，所述MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述PD-1mAb的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。2.根据权利要求1所述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的结构组成为CD8leader-MSLNscFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ-IRES-PD-1mAb。3.根据权利要求2所述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，所述CD8leader可表达引导新合成的蛋白质进行跨膜转移的引导肽，所述CD8leader的核苷酸序列SEQIDNO.1所示，所述MSLNscFv表示MSLN单链抗体，所述CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，且核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述CD28-CD137为共刺激结构域，所述CD28核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述CD137核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述CD3ζ为信号转导域，核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述IRES为核糖体识别位点，是实现同一载体高效共表达两个基因的元件，核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。4.根据权利要求1所述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，所述载体包括PUC19质粒、慢病毒载体。5.根据权利要求4所述的联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，所述慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。6.联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体的构建方法，用于构建如权利1-5任一项所述的联合...
【专利技术属性】
技术研发人员：田晓丽，
申请(专利权)人：上海怡豪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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