一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法技术

一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法，属于兽用生物制品技术领域。包括以下步骤：PCV2Cap基因的人工合成；含有PCV2Cap的昆虫表达载体的构建；含有昆虫表达质粒pFastBac

【技术实现步骤摘要】
一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs及其构建方法。
技术介绍
猪圆环病毒（Porcinecircovirus,PCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），无囊膜结构，含有共价闭合的单股环状负链DNA，病毒粒子直径为14～17nm，为已知最小的动物病毒之一。现已知PCV有两种血清型，即PCV1和PCV2，其中PCV1为非致病性病毒，而PCV2为致病性病毒。猪对PCV2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等排泄物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）、猪皮炎与肾炎综合症（PDNS）、增生性坏死性肺炎（PNP）、猪呼吸道综合症（PRDC）等疾病，这些与PCV2相关的疾病被统称为猪圆环病毒病（PCVDS）。猪圆环病毒现已成为全球广泛传播的猪病病毒，它具有流行范围广、各生长阶段猪感染严重、混合感染突出等特点。PCV2在我国流行始于2000年，在我国该病毒的阳性检出率也呈逐年上升的趋势，目前在许多省份危害严重，给我国生猪养殖业造成了巨大的经济损失，严重威胁了我国养猪业的发展。研究表明PCV2含有11个开放阅读框架（ORF），分别为ORF1～ORF11，其中ORF2编码的核衣壳蛋白（Cap）是PCV2的结构蛋白，也是其主要抗原蛋白，具有较高的免疫原性，能诱导中和抗体的产生，是构建重组疫苗的首选基因。以往研究发现，猪圆环病毒灭活疫苗存在效价不高，免疫原性不强等缺点，利用大肠杆菌原核表达系统表达的亚单位疫苗又存在糖基化不完全，诱导的抗体滴度不高等较难克服的缺陷，所以如何利用Cap基因制备DNA疫苗或亚单位疫苗就成了防治猪圆环病毒病（PCVDS）的关键。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs及其构建方法的技术方案。所述的一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（1）PCV2Cap基因的人工合成根据GenBank：ADK34040.1PCV2Cap蛋白序列设计得到密码子优化基因序列；（2）含有PCV2Cap的昆虫表达载体的构建通过步骤（1）得到的密码子进行PCR扩增得到目的基因，将目的基因通过限制性内切酶位点BamHⅠ和SpeⅠ连接到昆虫表达载体pFastBacTM1中，得到昆虫表达质粒pFastBacTM1-PCV2Cap；（3）含有昆虫表达质粒pFastBacTM1-PCV2Cap菌株的获得将昆虫表达质粒pFastBacTM1-PCV2Cap通过热激转化方法转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，然后通过氨苄青霉素抗性筛选，抽提质粒，双酶切及测序鉴定，得到阳性克隆菌株；（4）含有重组杆状病毒表达质粒Bacmid-PCV2Cap菌株的获得将含有昆虫表达质粒pFastBacTM1-PCV2Cap菌株经扩增后，用试剂盒抽提方法得到质粒pFastBacTM1-PCV2Cap，该质粒通过热激转化方法转化到大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，质粒pFastBacTM1-PCV2Cap与Bacmid通过TN7转座子实现基因重组得到Bacmid-PCV2Cap，利用含庆大霉素、四环素和卡那霉素的抗性蓝白斑筛选方法及PCR、测序鉴定，得到阳性克隆菌株；（5）重组杆状病毒表达质粒Bacmid-PCV2Cap的获得挑取步骤（4）中阳性白色克隆菌株于抗性培养基中扩增，利用质粒大抽方法得到重组杆状病毒表达质粒Bacmid-PCV2Cap；（6）PCV2Cap重组AcNPVs的获得将重组杆状病毒质粒Bacmid-PCV2Cap通过FuGENE®6TransfectionReagent试剂转染昆虫细胞SF9，培养3～5天待大部分细胞出现明显病变后收获培养上清，即为PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs；（7）PCV2型Cap蛋白的表达将步骤（6）得到的Cap蛋白重组AcNPVs感染HighFive细胞，得到大量表达Cap蛋白。所述的一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法，其特征在于所述的步骤1）中密码子优化基因序列如SEQIDNO.1所示，其翻译蛋白质氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述的一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法，其特征在于所述的步骤2）中PCR扩增引物为特异性引物PCV2Cap-F和PCV2Cap-R，所述的PCV2Cap-F的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述的PCV2Cap-R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。所述的一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法，其特征在于所述的步骤3）中测序鉴定采用特异性引物pFastBac-cap-p，所述的pFastBac-cap-p的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。所述的一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法，其特征在于所述的步骤4）中测序鉴定采用特异性引物Bacmid-cap-p，所述的Bacmid-cap-p的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。所述的一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法，其特征在于所述的步骤4）中PCR鉴定采用特异性引物Bacmid-cap-F和Bacmid-cap-R，所述的Bacmid-cap-F的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，所述的Bacmid-cap-R的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。所述的一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法所得到的表达菌株PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs。通过本专利技术的方法能够构建出高效表达猪圆环病毒2型主要免疫原性蛋白Cap的真核表达载体，该真核表达载体能够大量表达Cap蛋白，可用于生产安全、有效的重组杆状病毒疫苗。附图说明图1为优化PCV2Cap蛋白核苷酸序列示意图；图2为昆虫表达载体pFastBacTM1示意图；图3为重组昆虫表达载体pFastBacTM1-PCV2Cap示意图；图4为重组昆虫表达载体pFastBacTM1-PCV2CapPCR鉴定示意图；图5为重组杆状病毒表达质粒Bacmid-PCV2Cap转座位点示意图；图6为重组杆状病毒表达质粒Bacmid-PCV2CapPCR鉴定示意图；图7为PCV2Cap重组AcNPVs形成过程示意图；图8为Cap蛋白表达SDS-PAGE电泳示意图。具体实施方式以下结合实施例来进一步说明本专利技术。实施例1：PCV2Cap目的基因的合成从GenBank序列库中获取ADK34040.1的PCV2Cap蛋白序列，根据昆虫杆状病毒表达系统的密码子使用频率，对Cap蛋白序列的密码子进行优化，以便cap基因在杆状病毒表达系统中进行高效表达，得到Cap蛋白序列优化密码子的核苷酸序列如图1所示，该核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其翻译蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。实施例2：PCV2Cap的昆虫表达载体的构建（1）通过特异性引物，利用合成序列作为模板，进行PCR反应得到目的基因，反应体系及特异性引物序列如下：特异性引物序列：50ul反应体系：PCR扩增程序：（2）将目的基因cap与昆虫表达载体pFastBa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（1）PCV2Cap基因的人工合成根据GenBank：ADK34040.1 PCV2Cap蛋白序列优化设计得到其核苷酸序列和翻译蛋白的氨基酸序列；（2）含有PCV2Cap的昆虫表达载体的构建通过步骤（1）得到的密码子进行PCR扩增得到目的基因，将目的基因通过限制性内切酶位点BamHⅠ和SpeⅠ连接到昆虫表达载体pFastBac

【技术特征摘要】
1.一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（1）PCV2Cap基因的人工合成根据GenBank：ADK34040.1PCV2Cap蛋白序列优化设计得到其核苷酸序列和翻译蛋白的氨基酸序列；（2）含有PCV2Cap的昆虫表达载体的构建通过步骤（1）得到的密码子进行PCR扩增得到目的基因，将目的基因通过限制性内切酶位点BamHⅠ和SpeⅠ连接到昆虫表达载体pFastBacTM1中，得到昆虫表达质粒pFastBacTM1-PCV2Cap；（3）含有昆虫表达质粒pFastBacTM1-PCV2Cap菌株的获得将昆虫表达质粒pFastBacTM1-PCV2Cap通过热激转化方法转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，然后通过氨苄青霉素抗性筛选，抽提质粒，双酶切及测序鉴定，得到阳性克隆菌株；（4）含有重组杆状病毒表达质粒Bacmid-PCV2Cap菌株的获得将含有昆虫表达质粒pFastBacTM1-PCV2Cap菌株经扩增后，用试剂盒抽提方法得到质粒pFastBacTM1-PCV2Cap，该质粒通过热激转化方法转化到大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，质粒pFastBacTM1-PCV2Cap与Bacmid通过TN7转座子实现基因重组得到Bacmid-PCV2Cap，利用含庆大霉素、四环素和卡那霉素的抗性蓝白斑筛选方法及PCR、测序鉴定，得到阳性克隆菌株；（5）重组杆状病毒表达质粒Bacmid-PCV2Cap的获得挑取步骤（4）中阳性白色克隆菌株于抗性培养基中扩增，利用质粒大抽方法得到重组杆状病毒表达质粒Bacmid-PCV2Cap；（6）PCV2Cap重组AcNPVs的获得将重组杆状病毒质粒Bacmid-PCV2Cap通过FuGENE®6TransfectionReagent试剂转染昆虫细胞SF9，培养3～5天待大部...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴程雨，陈玮，舒建洪，
申请(专利权)人：杭州洪扬生物工程有限公司，杭州洪晟生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33