一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，具体的，本发明专利技术公开了一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，由AAV2/9‑N‑shRNA3质粒和辅助质粒共转染AAV‑293细胞后得到shRNA重组腺相关病毒；所述干扰片段序列的Top strand如SEQ ID NO.7所示，bottom strand如SEQ ID NO.8所示；所述AAV2/9‑N‑shRNA3质粒，由经BamHI和EcoRI双酶切的pHBAAV‑U6‑CMV‑ZsGreen载体与干扰片段基因连接、转化后构建而成，并研究AAV2/9‑N‑shRNA3对预防犬瘟热的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒。
技术介绍
犬瘟热(Caninedistemper,CD)是由犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。据报道，43个国家、272种不同的动物可以通过自然途径或者试验感染犬瘟热病毒。在自然条件下，犬瘟热病毒能够使犬科(狗、狐狸、豺、狼)、鼬科(鼬鼠、雪貂、水貂、水獭等)、浣熊科(浣熊、熊猫)、猫科动物(如狮子、东北虎、远东豹)等多科动物以及海狮和猴发生感染。敏感动物感染犬瘟热病毒后，典型症状是双相热，并出现抽搐、口吐白沫等神经症状和不同程度的胃肠炎、卡他性肺炎。在自然条件下，犬瘟热病毒通过上呼吸道和飞沫传播，发病率几乎达100％。其高发病率、高死亡率的流行特点对毛皮动物养殖业、珍稀动物及野生动物保护都造成了巨大损失。尤其是犬瘟热病毒可以感染灵长类动物，给人们以警示，犬瘟热病毒有可能发展成为能感染人的新病毒。弱毒疫苗被广泛应用于预防犬和其它动物犬瘟热，然而，但被免疫动物不能得到完全保护，许多国家均有免疫群体暴发犬瘟热的报道，而且弱毒苗的使用，会在临床上带来散毒风险以及毒力返强的风险，临床上也不能通过抗体检测来鉴别野毒感染和疫苗免疫。因此，临床上亟需一种新型、安全、有效的生物制剂来预防犬瘟热。RNA干扰(RNAinterfernce，RNAi)的功能性中间分子—小干扰RNA(shortinterferingRNA，siRNA)可引导一种内切酶复合物剪切有同源序列的靶mRNA，导致mRNA降解，从而引起转录后基因沉默机制，干扰基因表达。该技术能对抗病毒所表达mRNA等外源基因的侵害，尤其是以病毒载体表达发夹RNA(shorthairpinRNA，shRNA)，具有特异、高效和持久的特点。腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)，是微小病毒科依赖病毒属，病毒颗粒大小约为20～26nm，完整的生活周期需要辅助病毒(通常为腺病毒或疱疹病毒)参与，接种动物后一过性感染，不会在动物体内复制，不会污染环境，没有潜在散毒危险，而且迄今从未发现野生型AAV对人体致病，重组AAV基因组序列上去除了大部分的野生型AAV基因组元件，进一步保证了安全性；AAV有多种血清型，不同血清型对不同组织的亲和力不同，适用于各种体内感染实验，能介导基因的长期稳定表达(可达半年以上)，具有表达时效长的优点，因此构建CDVshRNA腺相关病毒，用来预防犬瘟热，可以解决现阶段弱毒疫苗存在的安全性问题。
技术实现思路
本专利技术通过重组腺相关病毒技术，构建shRNA重组腺相关病毒，来预防犬瘟热，解决现阶段弱毒疫苗存在的安全性问题。本专利技术提供了一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，由AAV2/9-N-shRNA3质粒和过表达质粒、干扰质粒共转染AAV-293细胞后得到shRNA重组腺相关病毒；其中，所述AAV2/9-N-shRNA3质粒是将干扰片段重组至pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen载体得到的，所述干扰片段的序列的Topstrand如SEQIDNO.7所示，bottomstrand如SEQIDNO.8所示；所述过表达质粒、干扰质粒分别为为pAAV-RC9质粒和pHelper质粒。优选地，上述pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen载体经BamHI和EcoRI双酶切后，与干扰片段基因连接后得到所述AAV2/9-N-shRNA3质粒。本专利技术提供上述AAV2/9-N-shRNA3质粒的构建方法，包括如下步骤：S1.人工合成干扰序列shRNA3：Topstrand：gatccgccagtgaagagagttctcctgtctattcaagagatagacaggagaactctcttcactggttttttcbottomstrand：aattgaaaaaaccagtgaagagagttctcctgtctatctcttgaatagacaggagaactctcttcactggcgS2.将单链的引物退火成双链oligo序列，退火程序：95℃10min，75℃10min，55℃10min，35℃10min，15℃10min；S3.用限制性内切酶BamHI和EcoRI对载体pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen进行酶切，酶切完成后，胶回收；S4.将S2得到的的退火产物和S3经过酶切的载体进行连接得到连接产物，即可得到AAV2/9-N-shRNA3质粒，转化至感受态细胞，备用。优选地，S4中的连接反应体系(20uL)如下：退火产物1μl，酶切好的载体100-200ng，ligasebuffer2μl，T4ligase1μl，H2O补齐至20μl，以上连接反应体系在16℃过夜。优选地，其特征在于，S4中的转化步骤包括：将连接产物以Cacl2方法转化加入感受态细胞，于Amp抗性平板，37℃条件下培养过夜，得到转化后的NshRNA3；转化后的NshRNA3平板挑菌，于37℃条件下、250转/分钟，摇菌14小时，挑取阳性克隆子，保存备用。优选地，其特征在于，所述感受态细胞为大肠杆菌菌株stbl3感受态细胞。优选地，所述转染的反应体系如下:转染100mm平皿所需的转染复合物成分如下：10μL过表达质粒+20μLpHelper质粒+10μLAAV2/9-N-shRNA3+150μL转染试剂。优选地，转染AAV-293细胞的转染试剂为Lipo转染试剂。本专利技术的有益效果为：本专利技术通过重组腺相关病毒技术，构建shRNA重组腺相关病毒，用来预防犬瘟热，可以解决现阶段弱毒疫苗存在的安全性问题。附图说明图1为NshRNA3测序峰图。图2为QPCR检测靶基因表达量示意图。图3为WB结果示意图。图4为灰度扫描结果示意图。图5为标准曲线示意图。具体实施方式下面结合附图1-5以及具体实施例对本专利技术进行详细说明，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的方法，通常按照常规条件操作，未注明的材料来源均为市售，由于不涉及专利技术点，故不对其步骤进行详细描述。一、AAV2/9-N-shRNA3质粒的构建及鉴定S1.干扰片段序列设计人工合成上述干扰序列shRNA3(生工生物工程股份有限公司(上海))。S2.引物退火形成带粘性末端的双链片段引物是由上海生工合成PAGE胶纯化的oligo序列，分别稀释至100μM，将单链的引物退火成双链oligo序列，退火程序：95℃10min，75℃10min，55℃10min，35℃10min，15℃10min。S3.线性化载体的制备用限制性内切酶对载体pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen进行酶切，酶切体系(20μl)如下:表137℃温浴1～3小时酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。S4.干扰片段连接入载体连接反应体系(20μl)如下：表2以上连接液在16℃过夜。二、转化、测序与质粒提取将连接产物以Cacl2法转化DH5a感受态细胞，转化后的NshRNA平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，将菌液送测序，测序引物为载体上U本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，由AAV2/9‑N‑shRNA3质粒和过表达质粒、干扰质粒共转染AAV‑293细胞后得到预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒；其中，所述AAV2/9‑N‑shRNA3质粒是将干扰片段重组至pHBAAV‑U6‑CMV‑ZsGreen载体得到的，所述干扰片段的序列的Top strand如SEQ ID NO.7所示，bottom strand如SEQ ID NO.8所示；所述过表达质粒、干扰质粒分别为为pAAV‑RC9质粒和pHelper质粒。

【技术特征摘要】
1.一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，由AAV2/9-N-shRNA3质粒和过表达质粒、干扰质粒共转染AAV-293细胞后得到预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒；其中，所述AAV2/9-N-shRNA3质粒是将干扰片段重组至pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen载体得到的，所述干扰片段的序列的Topstrand如SEQIDNO.7所示，bottomstrand如SEQIDNO.8所示；所述过表达质粒、干扰质粒分别为为pAAV-RC9质粒和pHelper质粒。2.根据权利要求1所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen载体经BamHI和EcoRI双酶切后，与干扰片段基因连接后得到所述AAV2/9-N-shRNA3质粒。3.根据权利要求1所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，AAV2/9-N-shRNA3质粒的构建方法，包括如下步骤：S1.人工合成干扰序列shRNA3：Topstrand：gatccgccagtgaagagagttctcctgtctattcaagagatagacaggagaactctcttcactggttttttcbottomstrand：aattgaaaaaaccagtgaagagagttctcctgtctatctcttgaatagacaggagaactctcttcactggcgS2.引物退火形成带粘性末端的双链片段将单链的引物退火成双链oligo序列，退火程序：95℃10min，75℃10min，55℃10min，35℃10...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄娟，单虎，杨雅明，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37