一种快速高效的落地生根毛状根诱导和扩繁方法技术

本发明专利技术提供一种快速高效的落地生根毛状根诱导和扩繁方法，包括：（1）将无菌的落地生根外植体用野生型和含有GUS报告基因A4农杆菌侵染液侵染；（2）侵染后的外植体置于无抗MS固体培养基上，黑暗条件下进行共培养，再在有抗MS固体培养基中进行共培养；(3)在有抗MS固体培养基上进行筛选培养，（4）在有抗MS固体培养基上进行继代培养；（5）在MS液体培养基上进行扩大培养；(6)对含有GUS报告基因的毛状根进行GUS染色探究转化效率。本发明专利技术方法适用于多种落地生根品种毛状根的诱导，具有取材方便、适用性强、操作简便、诱导速度快、遗传稳定及节约成本等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种快速高效的落地生根毛状根诱导和扩繁方法
本专利技术涉及农业生物技术研究领域，特别是提供一种对落地生根的毛状根进行快速诱导和扩繁，并对调控落地生根相关性状基因的转化提供了快速准确的研究方法。
技术介绍
落地生根(Bryohyllmpinnatum)又名灯笼花，隶属景天科(Crassulaceae)落地生根属(Bryohyllm)，为多年生肉质草本植物，是一种重要的中药材，全草可入药,可解毒消肿，活血止痛，拔毒生肌，其中含有大量丰富的化学成分,除具有观赏价值外,还具有广泛的药理作用,具有巨大的开发应用价值。在落地生根的繁育和开发研究中，对落地生根中基因的克隆和基因功能验证就尤为重要。研究表明，落地生根在进行基因功能验证的方法中，一般采用拟南芥或者诱导愈伤再生，生长周期较长且转化效率较低。因此对落地生根毛状根进行快速诱导和提高基因转化效率十分必要。落地生根外植体用发根农杆菌诱导，其中发根农杆菌菌种是关键物质。A4是发根农杆菌的一种，已有文献报道可以利用A4农杆菌诱导植物发根。发根农杆菌诱导植物产生毛状根是一个复杂的过程，与之含有的Ri质粒有着密切的关系，主要是由Ri质粒中Ori区、Vir区及T-DNA区三部分共同作用的结果。本专利技术研究了A4发根农杆菌对落地生根的诱导时间和浓度，培养时间等，并且构建了转化的带有GUS报告基因的A4发根农杆菌，和对转化的毛状根进行了GUS染色。通过实验研究发现野生型和转化的A4发根农杆菌最合适的OD600值，能使落地生根高效诱导出毛状根，并能带有GUS基因而染成蓝色。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种直观、经济、简便的快速诱导落地生根毛状根以及提高转基因效率的方法，以便应用于落地生根毛状根诱导，构建了转化的带有GUS报告基因的A4发根农杆菌，并对转化的毛状根进行了GUS染色鉴定以探究转化效率。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种快速高效的落地生根毛状根诱导和扩繁方法，包括以下步骤：（1）将无菌的2-3周龄的外植体（落地生根苗）分别用侵染液A和侵染液B侵染处理5-10分钟，所述侵染液A为野生型A4发根农杆菌，侵染液B为转入GUS报告基因的A4发根农杆菌；（2）将侵染后的外植体置于无抗MS固体培养基上，黑暗条件下进行共培养24-48小时；（3）将外植体转移到有抗MS固体培养基中进行共培养，2-3周以后外植体分化形成毛状根；（4）剪下毛状根，在有抗MS固体培养基上进行筛选培养，两周以后筛选出生长速度快的落地生根毛状根；（5）再在有抗MS固体培养基上进行继代培养，得到脱毒的落地生根毛状根；（6）剪取毛状根，在MS液体培养基上进行扩大培养，得到大量的落地生根毛状根；（7）用B侵染液诱导出的落地生根毛状根进行GUS染色探究转化效率。作为更为具体的实施方式，步骤（1）中，所述侵染液A由50mlOD600值为0.8的农杆菌A4进行离心，用等体积MS液体进行重悬得到。作为更为具体的实施方式，步骤（1）和步骤（7）中，所述侵染液B由50mlOD600值为0.8带有GUS报告基因的农杆菌A4进行离心，用等体积MS液体进行重悬得到。作为优化的实施方式，步骤（2）和步骤（3）中，所述共培养温度为25℃。作为优化的实施方式，步骤（3）和步骤（4）中，所述有抗MS固体培养基为100mg/ml头孢的MS固体培养基。作为优化的实施方式，步骤（5）中，所述有抗MS固体培养基为含有50mg/ml头孢的MS固体培养基。作为优化的实施方式，步骤（5）中，所述继代培养次数为2-3次。作为优化的实施方式，步骤（4）和步骤（6）中，所述毛状根的剪取长度为2-3cm。本专利技术采用OD600值为0.8的野生型A4发根农杆菌对落地生根进行诱导，能高效诱导出大量毛状根；诱导出的毛状根中带有GUS报告基因，能被染成蓝色。本专利技术采用的化学染色方法简便直观，能快速探究出落地生根的诱导转化效率。本专利技术具有操作简单，分析速度快，使用试剂价格低廉等优点。具体实施方式下面给出本专利技术的实施例，以详细说明本专利技术。实施例1：一种快速高效诱导大叶落地生根毛状根的方法，包括步骤：（1）侵染液A：由50mlOD600值为0.8的A4农杆菌进行离心并用等体积MS液体进行重悬得到，混匀备用；（2）侵染液B：50mlOD600值为0.8的带有GUS报告基因的A4农杆菌进行离心并用等体积MS液体进行重悬得到，混匀备用；（3）取两瓶2周龄的大叶落地生根，分别剪段，一组加入到50毫升侵染液A中，使外植体完全浸泡在液体中，侵染5-10分钟。另外一组加入到50毫升侵染液B中，同样侵染5-10分钟；（4）置于无抗MS固体培养基上，25°C条件下暗培养48h；（5）共培养结束以后，转移至含有100mg/ml头孢的MS固体培养基，两周到三周以后外植体分化形成毛状根；（6）剪取2-3cm毛状根，在加入100mg/ml头孢的MS固体培养基上进行筛选培养，两周以后筛选出生长速度快的落地生根毛状根。再在含50mg/ml头孢的MS固体培养基上进行继代培养。继代培养2-3次以后，得到脱毒的落地生根毛状根；（7）剪取2-3cm毛状根，在MS液体培养基上进行扩大培养，一月后得到生长快,侧根分支多的大叶落地生根毛状根；（8）对B侵染液侵染并培养的落地生根毛状根进行GUS染色发现能够染上颜色，且变蓝，根据颜色判断转化效率。实施例2：一种快速高效诱导棒叶落地生根毛状根的方法，包括步骤：（1）侵染液A：由50mlOD600值为0.8的A4农杆菌进行离心并用等体积MS液体进行重悬得到，混匀备用。（2）侵染液B：50mlOD600值为0.8的带有GUS报告基因的A4农杆菌进行离心并用等体积MS液体进行重悬得到，混匀备用。（3）取两瓶2周龄的棒叶落地生根，分别剪段。一组加入到50毫升侵染液A中，使外植体完全浸泡在液体中，侵染5-10分钟。另外一组加入到50毫升侵染液B中，同样侵染5-10分钟。（4）置于MS固体培养基上，25°C条件下暗培养48h。（5）共培养结束以后，转移至含有100mg/ml头孢的MS固体培养基，两周到三周以后外植体分化形成毛状根。（6）剪取2-3cm毛状根，在加入100mg/ml头孢的MS固体培养基上进行筛选培养。两周以后筛选出生长速度快的落地生根毛状根。在含50mg/ml头孢的MS固体培养基上进行继代培养。继代培养2-3次以后，得到脱毒的落地生根毛状根。（7）剪取2-3cm毛状根，在MS液体培养基上进行扩大培养。得到生长快,侧根分支多的棒叶落地生根毛状根。（8）对B侵染液侵染并培养的落地生根毛状根进行GUS染色发现能够染上颜色，且变蓝，根据颜色判断转化效率。还需要说明的是，本专利技术的具体实施例只是用来示例性说明，并不以任何方式限定本专利技术的保护范围，本领域的相关技术人员可以根据上述一些说明加以改进或变化，但所有这些改进和变化都应属于本专利技术权利要求的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速高效的落地生根毛状根诱导和扩繁方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将无菌的2‑3周龄的落地生根外植体分别用侵染液A和侵染液B侵染处理5‑10分钟，所述的侵染液A为野生型A4发根农杆菌，侵染液B为转入GUS报告基因的A4发根农杆菌；（2）将侵染后的外植体置于无抗MS固体培养基上，黑暗条件下进行共培养24‑48小时；（3）将外植体转移到有抗MS固体培养基中进行共培养，2‑3周以后外植体分化形成毛状根；（4）剪下毛状根，在有抗MS固体培养基上进行筛选培养，两周以后筛选出生长速度快的落地生根毛状根；（5）再在有抗MS固体培养基上进行继代培养，得到脱毒的落地生根毛状根；（6）剪取毛状根，在MS液体培养基上进行扩大培养，得到大量的落地生根毛状根；（7）用B侵染液诱导出的落地生根毛状根进行GUS染色探究转化效率。

【技术特征摘要】
1.一种快速高效的落地生根毛状根诱导和扩繁方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将无菌的2-3周龄的落地生根外植体分别用侵染液A和侵染液B侵染处理5-10分钟，所述的侵染液A为野生型A4发根农杆菌，侵染液B为转入GUS报告基因的A4发根农杆菌；（2）将侵染后的外植体置于无抗MS固体培养基上，黑暗条件下进行共培养24-48小时；（3）将外植体转移到有抗MS固体培养基中进行共培养，2-3周以后外植体分化形成毛状根；（4）剪下毛状根，在有抗MS固体培养基上进行筛选培养，两周以后筛选出生长速度快的落地生根毛状根；（5）再在有抗MS固体培养基上进行继代培养，得到脱毒的落地生根毛状根；（6）剪取毛状根，在MS液体培养基上进行扩大培养，得到大量的落地生根毛状根；（7）用B侵染液诱导出的落地生根毛状根进行GUS染色探究转化效率。2.根据权利要求1所述的快速高效的落地生根毛状根诱导和扩繁方法，其特征在于，步骤（1）中，所述侵染液A由50mlOD600值为0.8的农杆菌A4进行离心，用等体积MS液体进行重悬得到。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：徐秉良，李世娟，李隆，姚军胜，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62