一种胰高血糖素样肽-1的重组表达方法技术

一种胰高血糖素样肽‑1的重组表达方法，包括以下步骤1)构建一种含有编码小泛素相关修饰物的DNA序列和编码重组胰高血糖素样多肽‑1的DNA序列的融合基因SUMO‑rolGLP‑1；2)构建一种包括融合基因SUMO‑rolGLP‑1的大肠杆菌表达载体和高表达融合基因SUMO‑rolGLP‑1的大肠杆菌工程菌；3)对大肠杆菌工程菌株进行诱导表达，获得融合蛋白；4)使用镍‑琼脂糖凝胶分离纯化融合蛋白；5)将步骤4)纯化的蛋白使用蛋白酶酶切，获得SUMO和rolGLP‑1蛋白的混合物；6)步骤5)得到的混合物使用Ni‑FF吸附SUMO蛋白后，超滤管离心收集rolGLP‑1蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种胰高血糖素样肽-1的重组表达方法
本专利技术涉及胰高血糖素样肽-1的重组表达方法。
技术介绍
根据糖尿病的发病机制，可将其主要分成三种类型：1型糖尿病——又称胰岛素依赖性糖尿病、2型糖尿病——又称非胰岛素依赖性糖尿病、妊娠糖尿病，其中2型糖尿病最常见，约占全部糖尿病患者的九成。在哺乳动物的肠道中，有一种L细胞在摄取营养的刺激下分泌的约3kD的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，具有促进胰岛素分泌的功能。GLP-1通过与遍及在胰腺、大脑、胃肠道、心脏、肺等组织中的GLP-1受体(GLP-1R)相联系而表现血糖调节的生理作用，但GLP-1R在胰腺中的分布量要远高于其他组织[3]。GLP-1R分泌于多重组织的特点决定了GLP-1复杂而广泛的生理功能。在生理学方面，GLP-1主要功能包括：①刺激胰岛素分泌。GLP-1是葡萄糖浓度依赖型激素，当血糖浓度高于正常水平时才会发挥促进胰岛素分泌作用，在不发生致命性低血糖的风险的前提下发挥降糖作用。②GLP-1能与胰岛α细胞结合遏制胰高血糖素分泌[8]。③抑制β细胞凋亡。Farilla等人发现，GLP-1能稳定胰岛的三维结构，抑制胰岛细胞减少；Hui[10]等人发现，GLP-1能抑制凋亡蛋白活性，促进抗凋亡蛋白的表达，从而发挥抑制β细胞凋亡的作用。④GLP-1能促进转录胰岛素基因，增殖胰岛细胞以及促进胰岛干细胞分化为β细胞而增殖β细胞。⑤抑制肠运动和胃排空，降低食欲，促进肝脏、脂肪、肌肉组织糖原的合成。我国是2型糖尿病患病人数最多的国家之一，发病率高达11.6％，糖尿病已成为威胁人们身体素质水平的严重公共卫生问题，每年的医疗花费给糖尿病患者和国家带来了沉重的负担，研制出新的无毒副作用的治疗糖尿病药物迫在眉睫。由于GLP-1无胃肠道副作用，保护胰岛β细胞、促进胰岛素分泌的安全降血糖作用，市场上主要开发出三类GLP-1类抗糖尿病药物：DDP-4抑制剂、GLP-1R激动剂、GLP-1类似物，现阶段已表现出良好的应用前景，且部分已用于临床。小泛素相关修饰物(SUMO)是一类广泛分布于各种真核生物细胞内约15kD的高度保守的小蛋白，它的结构和反应方式与泛素相似，但却具有不同的功能。SUMO化修饰和泛素化修饰的共同点是结合位点均为目的蛋白的赖氨酸残基，结合过程均需要活化酶、结合酶、连接酶的参与，但泛素化修饰的活化酶和连接酶种类众多，而SUMO化修饰的这两种酶只有一种，这很有可能是经SUMO修饰后的蛋白稳定性显著提高的原因。除了提高蛋白的稳定性，SUMO还可以抑制蛋白质降解，因为SUMO与泛素的结合位点均为赖氨酸，两者会竞争性的与底物结合，从而发挥抗蛋白酶水解功能。另外，SUMO化修饰还可以保持融合蛋白基因组的稳定性，使多肽正常折叠，提高融合蛋白的可溶性。胰高血糖素样肽-1作为一种小分子蛋白，极易降解难以纯化，如何改进现有的GLP-1重组表达方法，提高其产量简化纯化步骤成为现有技术中亟待解决的问题。
技术实现思路
为解决前述技术问题，本专利技术将GLP-1的序列重组得到rolGLP-1，再将SUMO与rolGLP-1融合，然后将它克隆到大肠杆菌表达系统中的pET22b表达载体上，构建出一个重组SUMO-rolGLP-1原核表达载体，使其在大肠杆菌中高效表达，使用Ni-FF分离纯化SUMO-rolGLP-1，再将SUMO蛋白酶酶切后的SUMO-rolGLP-1蛋白使用Ni-FF吸附SUMO蛋白，超滤管离心收集rolGLP-1。本专利技术采用的技术方案为，提供一种胰高血糖素样肽-1的重组表达方法，其特征是所述方法包括以下步骤1)构建一种含有编码小泛素相关修饰物(SUMO)的DNA序列和编码重组胰高血糖素样多肽-1(rolGLP-1)的DNA序列的融合基因SUMO-rolGLP-1；所述融合基因SUMO-rolGLP-1中，所述的编码重组胰高血糖素样多肽-1(rolGLP-1)的DNA序列中，二肽酶Ⅳ和胰蛋白酶识别位点已被去除，第8位的Ala被Ser取代，第26位和34位的Lys分别被Gln和Asp取代；所述融合基因SUMO-rolGLP-1的DNA序列如序列1所示。所述步骤1)中，获得所述融合基因SUMO-rolGLP-1的方法为通过重组PCR的方法将编码SUMO的DNA序列与编码rolGLP-1的DNA序列进行融合获得所述融合基因SUMO-rolGLP-1；具体过程包括：通过重组PCR的方法将SUMO基因与rolGLP-1基因进行融合，将SUMO-GLP-1融合基因克隆到pMD18T-Simple载体，获得pMD18T-Simple-SUMO-GLP-1，该载体即如序列1所示的融合基因SUMO-GLP-1的基因序列。2)构建一种包括融合基因SUMO-rolGLP-1的大肠杆菌表达载体pNK-EC-SUMO-rolGLP-1和高表达融合基因SUMO-rolGLP-1的大肠杆菌工程菌NK-SUMO-rolGLP-1，其具体步骤包括2.1)将步骤1)得到的融合基因SUMO-rolGLP-1克隆到pMD18T-Simple载体，获得包含融合基因SUMO-rolGLP-1的克隆载体pMD18T-Simple-SUMO-rolGLP-1；2.2)提供大肠杆菌表达载体pNK-EC-SUMO-rolGLP-1，所述大肠杆菌表达载体的构建过程如下：将步骤2.1)得到的克隆载体pMD18T-Simple-SUMO-rolGLP-1中的融合基因SUMO-rolGLP-1用BamHI和NdeI内切酶进行酶切，将酶切回收后的融合基因SUMO-rolGLP-1连入pET-22b(+)载体，构建得到大肠杆菌表达载体pNK-EC-SUMO-rolGLP-1；2.3)用步骤2.2)得到的大肠杆菌表达载体pNK-EC-SUMO-rolGLP-1转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选其中高表达的融合基因SUMO-rolGLP-1的菌株作为大肠杆菌工程菌NK-SUMO-rolGLP-1。3)对大肠杆菌工程菌株NK-SUMO-rolGLP-1进行诱导表达，获得SUMO-rolGLP-1融合蛋白。4)使用镍-琼脂糖凝胶(Ni-FF)分离纯化步骤3)得到的SUMO-rolGLP-1融合蛋白，5)将步骤4)纯化的SUMO-rolGLP-1蛋白使用SUMO蛋白酶酶切SUMO-rolGLP-1，获得SUMO和rolGLP-1多肽的混合物6)步骤5)得到的SUMO和rolGLP-1多肽的混合物使用Ni-FF吸附SUMO蛋白后，超滤管离心收集rolGLP-1蛋白。本专利技术提供的一种胰高血糖素样肽-1的重组表达方法，运用基因操作技术，获得了SUMO-rolGLP-1融合基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体获得pNK-EC-SUMO-rolGLP-1，并基于大肠杆菌表达载体pNK-EC-SUMO-rolGLP-1构建了大肠杆菌工程菌株NK-SUMO-rolGLP-1，通过对大肠杆菌工程菌株的诱导表达，将表达产物使用亲和层析进行分离纯化，可获得高纯的的SUMO-rolGLP-1蛋白，将SUMO-rolGLP-1蛋白使用SUMO蛋白酶进行酶切，酶切后产物再经过提纯后即可获得高纯度的rolGLP-1蛋白。附图说明图1为具体实施方式中步骤2.2)所述的大肠杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胰高血糖素样肽‑1的重组表达方法，其特征是所述方法包括以下步骤1)构建一种含有编码小泛素相关修饰物(SUMO)的DNA序列和编码重组胰高血糖素样多肽‑1(rolGLP‑1)的DNA序列的融合基因SUMO‑rolGLP‑1；所述融合基因SUMO‑rolGLP‑1中，所述的编码重组胰高血糖素样多肽‑1(rolGLP‑1)的DNA序列中，二肽酶Ⅳ和胰蛋白酶识别位点已被去除，第8位的Ala被Ser取代，第26位和34位的Lys分别被Gln和Asp取代；所述融合基因SUMO‑rolGLP‑1的DNA序列如序列1所示；所述步骤1)中，获得所述融合基因SUMO‑rolGLP‑1的方法为通过重组PCR的方法将编码SUMO的DNA序列与编码rolGLP‑1的DNA序列进行融合获得所述融合基因SUMO‑rolGLP‑1；具体过程包括：通过重组PCR的方法将SUMO基因与rolGLP‑1基因进行融合，将SUMO‑GLP‑1融合基因克隆到pMD18 T‑Simple载体，获得pMD18 T‑Simple‑SUMO‑GLP‑1，该载体如序列1所示的融合基因SUMO‑GLP‑1的基因序列；2)构建一种包括融合基因SUMO‑rolGLP‑1的大肠杆菌表达载体pNK‑EC‑SUMO‑rolGLP‑1和高表达融合基因SUMO‑rolGLP‑1的大肠杆菌工程菌NK‑SUMO‑rolGLP‑1；3)对大肠杆菌工程菌株NK‑SUMO‑rolGLP‑1进行诱导表达，获得SUMO‑rolGLP‑1融合蛋白；4)使用镍‑琼脂糖凝胶(Ni‑FF)分离纯化步骤3)得到的SUMO‑rolGLP‑1融合蛋白；5)将步骤4)纯化的SUMO‑rolGLP‑1蛋白使用SUMO蛋白酶酶切SUMO‑rolGLP‑1，获得SUMO和rolGLP‑1蛋白的混合物；6)步骤5)得到的SUMO和rolGLP‑1蛋白的混合物使用Ni‑FF吸附SUMO蛋白后，超滤管离心收集rolGLP‑1蛋白。...

【技术特征摘要】
1.一种胰高血糖素样肽-1的重组表达方法，其特征是所述方法包括以下步骤1)构建一种含有编码小泛素相关修饰物(SUMO)的DNA序列和编码重组胰高血糖素样多肽-1(rolGLP-1)的DNA序列的融合基因SUMO-rolGLP-1；所述融合基因SUMO-rolGLP-1中，所述的编码重组胰高血糖素样多肽-1(rolGLP-1)的DNA序列中，二肽酶Ⅳ和胰蛋白酶识别位点已被去除，第8位的Ala被Ser取代，第26位和34位的Lys分别被Gln和Asp取代；所述融合基因SUMO-rolGLP-1的DNA序列如序列1所示；所述步骤1)中，获得所述融合基因SUMO-rolGLP-1的方法为通过重组PCR的方法将编码SUMO的DNA序列与编码rolGLP-1的DNA序列进行融合获得所述融合基因SUMO-rolGLP-1；具体过程包括：通过重组PCR的方法将SUMO基因与rolGLP-1基因进行融合，将SUMO-GLP-1融合基因克隆到pMD18T-Simple载体，获得pMD18T-Simple-SUMO-GLP-1，该载体如序列1所示的融合基因SUMO-GLP-1的基因序列；2)构建一种包括融合基因SUMO-rolGLP-1的大肠杆菌表达载体pNK-EC-SUMO-rolGLP-1和高表达融合基因SUMO-rolGLP-1的大肠杆菌工程菌NK-SUMO-rolGLP-1；3)对大肠杆菌工程菌株NK-SUMO-rolGLP-1进行诱导表达，获得SUMO-rolGLP-1融合蛋白；...

【专利技术属性】
技术研发人员：张耀方，王英超，李涛，李天俊，许艳玲，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：天津,12