一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体制造技术

本发明专利技术涉及一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体，属于基因工程领域，本发明专利技术从高产油卷枝毛霉WJ11克隆获得二羧酸转运体dit基因，连接至整合型质粒pMAT1552上，转化到卷枝毛霉缺陷型菌株Mu402中，通过同源重组将dit基因整合到卷枝毛霉的基因组上，得到重组菌株Mc‑Dit，最终实现了dit基因在卷枝毛霉MU402中的表达，过表达菌株Mc‑Dit胞内油脂脂肪酸组成变化不大，但在过表达菌株Mc‑Dit菌株油脂总脂肪酸含量提了33.76%，胞内油脂含量最多可以达到细胞干重的17.67%。

【技术实现步骤摘要】
一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体
本专利技术涉及一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体，属于基因工程领域。本专利技术通过同源重组技术过量表达二羧酸转运体(dit)基因，大大提高卷枝毛霉中的油脂产量。
技术介绍
现在，人民生活水平日益提高，越来越多的人重视身体健康与生活质量。膳食油脂的营养成分与慢性病的发生密切相关，油脂中重要的活性多不饱和脂肪酸，如γ-亚麻酸（GLA）、α-亚麻酸（ALA）、紫草酸（十八碳四烯酸、SDA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA），可以调节体内脂质代谢，预防多种慢性疾病的发生。γ-亚麻酸为人体必需脂肪酸，是人体合成活性多不饱和脂肪酸的前体物质，需要从膳食中获得。目前工业化的γ-亚麻酸大多来源于植物，如月见草、玻璃苣油和黑加仑籽油。然而植物因受产地、气候的影响，生长周期短、产量不稳定，不能满足市场需求。因此，寻找新型油脂资源成为当前研究的热点。产油微生物由于其油脂含量高，生长周期短，碳源利用广谱等特点备受关注，通过微生物产生的油脂以及其衍生品来代替部分植物资源，可能在未来生物产油产业中发挥重要作用。产油微生物细胞工厂是指利用产油微生物，发酵过程中通过添加过量的碳源，如碳水化合物、碳氢化合物等，使得微生物胞内脂肪酸以甘油三酯的方式大量储存在自身体内，进而将细胞转变成工厂。卷枝毛霉是全球首次利用微生物商业化培养生产油脂的菌株。卷枝毛霉被用来作为产油微生物研究的模式菌种，然而，本研究中分离获得新菌株WJ11，其所产生的脂质可以占到细胞干重的36%，且其基因组测序已完成，遗产背景与产油机制研究较为深入，同时其基因操作简单，遗传工具较为齐全，比较适于进行细胞工厂制备。卷枝毛霉能够大量产生对人体具有重要生理功能的γ-亚麻酸(GLA)，这也是其主要的商业价值。二羧酸转运体(2-oxoglutarate/malatetransporter，dit)基因是脂质合成的关键因素之一。产油真菌通常在碳源充足，其它营养成分（如氮、磷、硫等）缺乏的条件下，线粒体中三羧酸循环受阻，导致柠檬酸大量积累在线粒体中，此时柠檬酸被转运到细胞质中由柠檬酸裂解酶裂解产生脂肪酸合成底物乙酰辅酶A和草酸乙酰。乙酰辅酶A为细胞中油脂合成前体物质，进而通过生化反应被用于合成脂肪酸，而脂肪酸则以甘油三酯的形式储存在细胞内，从而形成微生物油脂。据报道，二羧酸转运体能够将细胞质内的苹果酸等二羧酸透过线粒体细胞膜转运到线粒体内，进而促进柠檬酸的转出，为细胞油脂合成起到促进作用，因此二羧酸转运体对于微生物油脂合成与积累具有重要作用。本专利利用卷枝毛霉作为研究微生物产脂的细胞工厂的模式菌株，利用同源重组的基因工程方法来提高卷枝毛霉油脂产量，为大力推广卷枝毛霉的工业化应用提供指导，并且能够用微生物油脂提供高营养价值的多不饱和脂肪酸，符合人民对身体健康和高质量生活的日益增长的要求。
技术实现思路
本专利技术提供一种卷枝毛霉重组菌株Mu-Dit，包括二羧酸转运体（dit）基因在卷枝毛霉基因组上的整合并过量表达，与对照菌Mc1552相比生成的胞内油脂产量提高了33.76%，胞内油脂含量可以达到总脂肪酸的17.67%。本专利技术的技术方案是：提取卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）WJ11菌株的mRNA反转出cDNA，设计特异引物PCR扩增二羧酸转运体（dit）基因将该基因连接至整合型质粒pMAT1552上，然后将该重组质粒电转化到卷枝毛霉缺陷型菌株Mu402的原生质体中，挑选阳性克隆进行发酵培养，发酵条件为：采用Kendrick培养基，28℃，700rpm，进气量1v/vmin-1，pH6.0。发酵过程中，根据油脂积累规律采集样品，进行油脂含量与组成的测定。本专利技术还提供了编码二羧酸转运体（dit）基因，其基因核酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还提供了含有SEQIDNO:1的表达载体，能够表达二羧酸转运体（dit）基因，所述载体是卷枝毛霉表达载体。本专利技术成功的表达了二羧酸转运体，其蛋白质序列如SEQIDNO:2所示。有益效果本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体；构建了重组菌株Mc-Dit，与对照菌Mc1552相比生成的胞内油脂产量提高了33.76%，胞内油脂含量可以达到总脂肪酸的17.67%。附图说明图1是卷枝毛霉重组菌株的PCR验证图，其中M代表标准蛋白分子量；0代表对照菌株Mc1552；1-3代表卷枝毛霉重组菌株Mc-Dit。图2是卷枝毛霉重组菌株的dit基因mRNA表达水平测定图。具体实施方式实施例1：二羧酸转运体（dit）基因信息学分析根据已测序的WJ11的基因组信息，查找到二羧酸转运体（dit）基因（000239.15，2129bp）（其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示），通过基因序列进行信息学分析，该序列编码区为1701bp碱基序列，可编码566个氨基酸（其蛋白质序列如SEQIDNO:2），预计分子量为60.62kDa，PI6.56，该序列编码的蛋白与来自Mucorambiguus的二羧酸转运体（dit）基因（NCBI基因ID：GAN03794.1）和Choanephoracucurbitarum的苹果酸转运体YflS基因（NCBI基因ID：OBZ90888.1）的同源性分别为67%和75%，因此，初步确定该基因可以编码卷枝毛霉WJ11的二羧酸转运体。实施例2：重组质粒构建将卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）WJ11菌株接种在含100mLKendrick培养基（葡萄糖30g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，酒石酸铵3.3g/L，KH2PO47.0g/L，Na2HPO42.0g/L，酵母提取物1.5g/L，CaCl20.076g/L，FeCl3·6H2O8mg/L，ZnSO4·7H2O1mg/L，CuSO4·5H2O0.1mg/L，Co(NO3)2·6H2O0.1mg/L，MnSO4·5H2O0.1mg/L）的500mL带挡板的锥形瓶中，28℃，150rpm，培养24h，抽滤收集菌体，提取DNA。根据已测序的WJ11的基因组信息，查找到二羧酸转运体（Dit）基因（scaffold00239.15,2129bp）（其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示），根据基因序列设计特异引物MuDit-F和MuDit-R，以卷枝毛霉DNA为模板进行PCR,MuDit-F：5’–ACTTTTATATACAAAATAACTAAATCTCGAGATGCCAAAAGAGCCGTCTAT–3’，MuDit-R：5’–ACTAGTCGCAATTGCCGCGGCTCGAGTCAACACCAGCCCAAAAGTT–3。’PCR反应参照PrimeSTARHSDNAPolymerase（Takara）说明书进行试验，反应条件为95℃变性3min后开始循环，然后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环后，再于72℃延伸10min，降温至4℃保持5min。扩增得到2129bp的PCR片段，回收片段与pMAT1552载体连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板（蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于提高卷枝毛霉产油量的二酸酸转运体基因（

【技术特征摘要】
1.一种用于提高卷枝毛霉产油量的二酸酸转运体基因（dit），其特征是，如SEQIDNO:1所示的核酸，其特征在于编码一种卷枝毛霉二羧酸转运体。2.含有权利要求1所述核酸的表达载体，其特征是，能够表达卷枝毛霉二羧酸转运体，所述载体为卷枝毛霉表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋元达，杨俊换，杨武，李少琦，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37