基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种控制半矮秆多分蘖性状的基因fol‑a，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。本发明专利技术还同时公开了上述半矮秆多分蘖基因fol‑a编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所述。本发明专利技术还同时公开了基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol‑a的分子标记SNPE3。利用分子标记SNPE3，可以鉴定大麦中是否含有fol‑a半矮秆多分蘖基因。利用该标记进行fol‑a基因的半矮秆多分蘖育种辅助选择可以保证100％的准确率，加快大麦半矮秆多分蘖育种进度。

【技术实现步骤摘要】
基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的分子标记及其应用
本专利技术涉及鉴别大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的基因标记方法及相应引物，所述方法属于农业生物
，可以用于大麦半矮秆多分蘖种质的快速筛选和含fol-a突变基因的分子标记辅助育种。
技术介绍
人口增长、气候变化和自然环境破坏等诸多因素导致了全球粮食短缺，如何提高作物的产量成为育种家普遍关注的问题。上个世纪60年代，半矮秆基因的应用显著提高了作物产量，被称之为“绿色革命”(Pengetal.,1999；Monnaetal.,2002)，“绿色革命基因”涉及赤霉素代谢途径。半矮秆作物增加了作物的抗倒性，但同时也增加了肥料的投入量，导致了生产成本的提高和环境污染等问题。因此，迫切需要寻找一种新的遗传变异来提高作物的产量。分蘖和株高是影响作物产量和株型的两个非常重要的农艺性状(SakamotoandMatsuoka,2004；WangandLi,2008；Alqudahetal.,2016)，虽然他们受到光照，温、湿度、营养和种植方式等环境因素的影响，但是在很大程度上还是由遗传因素决定。因此，研究控制分蘖和株高的基因对于提高作物产量具有重要的意义。在大麦中，目前报道了5个半矮秆多分蘖基因，分别是int-c,mnd,gra-a,int-m和fol-a(Drukaetal.,2011；Hussienetal.,2014)。然而，只有int-c和mnd被克隆，int-c是水稻和玉米TB1基因的同源基因，mnd编码细胞色素P450蛋白酶(Ramsayetal.,2011；Mascheretal.,2014)，其他3个基因gra-a,int-m和fol-a分别定位在大麦染色体3HL，5HL和2HL上。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克隆了一个大麦半矮秆多分蘖基因fol-a，提供了一种与半矮秆多分蘖性状关联的分子标记；本专利技术所获得的分子标记SNPE3，可以鉴定大麦中是否含有fol-a半矮秆多分蘖基因。为了解决上述技术问题，本专利技术一种控制半矮秆多分蘖性状的基因fol-a，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所述。本专利技术还同时提供了上述半矮秆多分蘖基因fol-a编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO：3所述。本专利技术还同时提供了基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的分子标记SNPE3，以大麦作为物种，所述分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，正向引物为：BW370allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTTATGCTGGAACAAACCCAGGBowmanallele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTTATGCTGGAACAAACCCAGA反向引物(共同反向引物)ACGACACATTAACTAGGCCTTCC。注：带下划线的为接头引物。本专利技术还同时提供了利用上述分子标记SNPE3鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的方法，包括以下步骤：(1)提取待测大麦品种基因组DNA(采用CTAB法(Steinetal.,2001)；(2)利用分子标记SNPE3对大麦基因组DNA进行PCR扩增；(3)根据PCR产物荧光信号的差异，使用QuantStudioReal-TimePCR软件分析，进而鉴别出每个待测大麦的基因型(即，鉴定出属于纯合野生型，纯合突变型和杂合型，这3类基因型中的哪种)。作为本专利技术的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的方法的改进，步骤2)的KASParPCR反应体系为：1μL基因组DNA(浓度为100ng/μL)，0.1μL引物，1.4μL灭菌水和2.5μLKASPBuffer，反应总量为5μL；PCR反应在ABIViiA7荧光定量PCR仪上进行，反应程序为：95℃15min；94℃变性20s，61℃(-0.6℃/循环)退火60s，10个循环；再94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环；所述0.1μL引物中，2种正向引物浓度各为10pmol/L，反向引物(共同反向引物)浓度为30pmol/L。本专利技术使用的突变体材料BW370，它是由辐射诱变突变体Proctor与大麦品种Bowman多次回交获得的(Drukaetal.,2011，www.nordgen.org)；本专利技术利用突变体材料BW370，进行分子标记定位和RNA-Seq试验，克隆了控制BW370半矮秆多分蘖性状的基因fol-a，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所述。该半矮秆多分蘖基因fol-a编码的蛋白质具有SEQIDNO：3所述的氨基酸序列。相对应的，野生型大麦HORVU2Hr1G098820基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所述，其编码的蛋白质，具有如SEQIDNO：4所述的氨基酸序列。本专利技术的研究发现fol-a基因是由于其野生型大麦基因HORVU2Hr1G098820内含子3的第一个碱基由G变为A，使该基因的剪切方式发生改变，从而导致编码的蛋白发生改变，产生半矮秆多分蘖表型，该基因编码一种胰蛋白酶，不同于以前报道的大麦半矮秆多分蘖基因。利用该突变位点本专利技术设计了一个KASP标记能够快速准确的检测大麦材料中是否含有fol-a突变基因。即，本专利技术经序列分析发现，野生型大麦HORVU2Hr1G098820基因与半矮秆多分蘖突变体BW370的fol-a基因在核苷酸序列上存在一个单碱基突变，HORVU2Hr1G098820基因的第3个内含子第一个碱基由G变为A，该突变导致了基因剪切方式发生改变，从而导致编码蛋白提前终止，产生了半矮秆多分蘖的表型。半矮秆多分蘖突变体BW370和其野生型Bowman相比其外在表现为：叶片变细窄(叶宽约为野生型Bowman的1/2)，叶色变深，株高变矮(约为野生型Bowman的2/3)，分蘖增多(约为野生型Bowman1.52-1.84倍)。本专利技术利用生物技术克隆了一个大麦半矮秆多分蘖基因fol-a，它不同于以前报道的已克隆的大麦半矮秆多分蘖基因，利用其单碱基突变位点专利技术人设计了一个KASP标记SNPE3，该标记具有以下优点：1)、本专利技术所获得的基因标记是根据基因内部碱基突变设计的，因此不存在遗传交换，也不需要表型的进一步验证。2)、本专利技术设计的KASP标记直接利用采集的荧光信号进行基因分型，无需电泳、染胶、读带等过程，可以简单快速，高通量的鉴别大麦种质资源中是否含有fol-a基因。3)、利用本专利技术方法进行分子标记辅助选择育种，显著提高大麦品种的选择效率。4)、利用该标记进行fol-a基因的半矮秆多分蘖育种辅助选择可以保证100％的准确率，加快大麦半矮秆多分蘖育种进度。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1为fol-a基因结构及其与野生型的差异位点；图2突变体BW370和Bowman中基因fol-a的氨基酸序列对比；具体是突变体BW370半矮秆多分蘖基因fol-a和Bowman中相对应基因HORVU2Hr1G098820的氨基酸序列比对。图3为利用本专利技术设计的KASP标记SNPE3鉴定突变体BW370和Bowman的fol-a基因型。左上角为Bowman(在彩色图中显示为蓝色)，右下角的●为突变体BW370(在彩色图中显示为红色)，■为阴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.控制半矮秆多分蘖性状的基因fol‑a，其特征是：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。

【技术特征摘要】
1.控制半矮秆多分蘖性状的基因fol-a，其特征是：所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所述。2.如权利要求1所述的半矮秆多分蘖基因fol-a编码的蛋白质，其特征是：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO：3所述。3.基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的分子标记SNPE3，以大麦作为物种，其特征是：所述分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，正向引物为：BW370allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTTATGCTGGAACAAACCCAGGBowmanallele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTTATGCTGGAACAAACCCAGA反向引物ACGACACATTAACTAGGCCTTCC。4.利用如权利要求3所述的分子标记SNPE3鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：华为，谈聪，汪军妹，朱靖环，尚毅，李承道，杨建明，巫小建，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33