本发明专利技术公开了一种春兰CgWRKY53编码基因及其应用，CgWRKY53基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术通过对春兰栽培品种‘宋梅’CgWRKY53基因的克隆与鉴定，基因表达分析，并验证其功能，发现过表达CgWRKY53基因的拟南芥植株生长发育迟缓，植株矮化，叶片缩小，且卷曲变形等表型，可见该基因在兰花和其他植物生产、育种中将具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种春兰CgWRKY53基因及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种春兰CgWRKY53基因及其应用。
技术介绍
春兰（Cymbidiumgoeringii）为兰科（Orchidaceae）兰属（CymbidiumSw.）多年生草本植物，在我国分布于黄河流域以南大部分地区，生于海拔300～3000m的山地林缘、林中空地及灌丛草坡等多石湿润坡地上，是我国兰科植物（国兰）中分布最广、品种资源最丰富的种类之一。春兰株型纤小，清秀脱俗，花色淡雅，香气清幽，素有“花中君子”和“天下第一香”之美称，具有极高的观赏价值和经济价值。WRKY转录因子是一类主要存在于植物中的转录调控因子。研究表明WRKY转录因子参与多种生物和非生物胁迫反应，比如在水稻中，OsWRKY45-1、OsWRKY45-2基因的表达均在细菌病原菌侵染过程中被诱导。其中，OsWRKY45-1和OsWRKY45-2这两个基因过量表达会使得水稻的抗病能力增强。在较高温度下处理拟南芥植株后，AtWRKY25和AtWRKY26受正调控表达，AtWRKY33受负调控表达。这3个基因的突变体植株对热胁迫更敏感，表现出发芽减少及存活率降低的现象。研究发现，WRKY转录因子除了在植物防卫反应中起重要作用外，还参与植物生长发育等一系列生命活动，包括种子生长发育、果实的成熟、叶片的衰老、胚胎形成等过程。水稻OsWRKY31的过量表达抑制了侧根的形成和伸长，分析发现过表达植株中的生长素早期响应基因如OsIAA4和OsCrl1呈组成性表达。拟南芥WRKY13通过直接结合于NST2的启动子上正调控茎中木质素的生物合成。OsWRKY78RNAi植株表现为半矮秆，粒形变小，而过表达植株与野生型一样，说明OsWRKY78对水稻茎伸长和种子发育具有调节作用。利用基因工程技术，从春兰中克隆获得CgWRKY53基因，该基因在低温胁迫下表达差异较为明显，因此将CgWRKY53基因转入植物中，将具有广泛的用途。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有育种技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种春兰CgWRKY53基因。本专利技术的另一目的是提供春兰CgWRKY53基因在兰花育种中的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种春兰CgWRKY53基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的春兰CgWRKY53基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述的春兰CgWRKY53基因在植物生产和育种中的应用。含有所述的的春兰CgWRKY53基因的载体。含有所述的春兰CgWRKY53基因的宿主细胞。有益效果：与现有技术相比，本专利技术通过对春兰CgWRKY53基因的克隆与鉴定，基因的表达分析，验证其功能，发现过表达CgWRKY53基因的拟南芥植株生长发育迟缓，植株矮化，叶片缩小，且卷曲变形等表型，可见该基因在兰花和其他植物生产、育种中将具有广泛的应用前景。附图说明图1是春兰CgWRKY53基因克隆和构建的过表达载体图；图2a图是CgWRKY53在春兰各组织中的表达情况，其中，R表示根，P表示假鳞茎，L表示叶，F表示花；b图是春兰CgWRKY53基因在春兰低温胁迫0h、2h、6h、12h、24h、48h的表达情况；图3a图是酶切结果图，其中，M：DL2000Marker；CgWRKY53与pBI121连接后用SmaI和SnabI双酶切；b图是阳性重组子的筛选图，其中，M：DL2000Marker，目的条带大小为1080bp；图4是转基因拟南芥植株PCR结果图，其中，M：DL2000Marker；CK+：以载体质粒DNA为阳性对照；CK-：野生型DNA为阴性对照；水：空白对照；图5是转CgWRKY53基因植株与野生型拟南芥植株株型比较图，图中WT，野生型拟南芥；1-3，转CgWRKY53基因的不同株系；图6是转CgWRKY53基因植株与野生型COL拟南芥叶片比对图；WT，野生型拟南芥，3，转CgWRKY53基因株系3；图7是转CgWRKY53基因植株与野生型COL拟南芥叶片比对图；WT，野生型拟南芥；1-3，转CgWRKY53基因的不同株系；图8是转CgWRKY53基因植株与野生型拟南芥在低温胁迫下，冷胁迫相关基因表达情况比对图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1本实施例所采用的材料是春兰‘宋梅’叶片，采后速冻于液氮中，超低温冰箱（-80℃）保存。1）春兰叶片总RNA的提取按照TaKaRa植物总RNA提取试剂盒的说明书进行，具体操作为：将超低温冻存的春兰叶片迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；将研磨成粉状的样品加入到含有450μlBufferPE的1.5mL灭菌tube中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀；将裂解液12,000rpm，4℃离心5分钟；将上清液小心吸取到新的1.5mL灭菌tube中。加入上清液1/10体积的BufferNB，Vortex振荡混匀，12,000rpm，4℃离心5钟；将上清液小心吸取到新的1.5mL灭菌tube中，加入450μL的BufferRL，使用移液枪将溶液混合均匀；加入混合液1/2体积的无水乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀后，立即将混合液全部转入到RNASpinColumn中；12,000rpm，离心1分钟，弃滤液，将RNASpinColumn放回到2mlCollectionTube中；将500μL的BufferRWA加入至RNASpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；600μL的BufferRWB加入至RNASpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；向RNASpinColumn膜中央加入50μLDNaseI反应液，室温静置15分钟；向RNASpinColumn膜中央加入350μL的BufferRWB，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；将RNASpinColumn重新安置于2mLCollectionTube上，12,000rpm离心2分钟；将RNASpinColumn安置于1.5mL的RNaseFreeCollectionTube上，在RNASpinColumn膜中央处加入50μL的RNaseFreedH2O室温静置5分钟，12,000rpm离心2分钟洗脱RNA。所得RNA经浓度和纯度检测后存于-80℃冰箱保存备用。吸取2μLRNA利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示28S和18S条带较为清晰，28S条带亮度约为18S的两倍，RNA质量较好。通过微量核算蛋白测定仪检测RNA纯度，OD260/OD280为2.03，OD260/OD230为2.01，完整性较好，可用于反转录。2）第一链cDNA的合成以所得到的的总RNA为模板，使用TaKaRa反转录试剂盒进行反转录，使用Oligo(dT)作为锚定引物，反转录合成第一链cDNA。具体操作如下：在离心管中配制按照下列模板RNA/引物的顺序配制混合物，总量为10μL：模板1μg，Oligo(dT)Primer(50μM)1μL，dNTPMixture(10mMeach)1μL,剩余体积用RNase-freeddH2O补齐。65℃保温5min后，冰上迅本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种春兰
【技术特征摘要】
1.一种春兰CgWRKY53基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的春兰CgWRKY53基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡凤荣，景袭俊，刘倩，王连平，张鸽香，丁彦芬，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。