一种春兰CgWRKY2基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种春兰CgWRKY2编码基因及其应用，CgWRKY2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术通过对春兰栽培品种‘宋梅’CgWRKY2基因的克隆与鉴定，基因表达分析，并验证其功能，发现过表达CgWRKY2基因的拟南芥植株生长发育缓慢，植株矮化，并伴有叶片早枯等提前衰老的表型，可见该基因在兰花和其它植物生产、育种中将有广泛的用途。

【技术实现步骤摘要】
一种春兰CgWRKY2基因及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种春兰CgWRKY2基因及其应用。
技术介绍
兰科（Orchidaceae）是开花植物中最大科之一，全世界含有25000多种，约占所有开花植物的10%。春兰（Cymbidiumgoeringii）属于兰科兰属中的小花型地生兰种类，其花型奇特、花色淡雅，花香清幽，叶姿优美，观赏价值和经济价值极高。春兰对生长环境要求较高，在生长过程中极易受到高温、低温、干旱等恶劣环境影响，严重时，会导致园艺观赏品质下降，甚至植株死亡。因此，研究植物应对非生物胁迫的分子机制以及鉴定具有抗逆功能的基因对春兰育种和生产具有重要意义。在植物细胞信号转导途径中，WRKY转录因子被认为是植物生长和多种胁迫响应的关键枢纽，为植物的遗传改良提供重要依据。WRKY转录因子是植物中最大的调节蛋白家族之一，参与多种生理过程，其中，最突出的是对生物和非生物胁迫的应激反应。有报道表明WRKY基因可以增强植株对逆境胁迫的耐受性。向日葵HaWRKY76转基因植株对水涝胁迫表现出更强的抗逆性，产量也明显增多。AtWRKY25的过表达增强拟南芥的耐盐性。AtWRKY57在水稻中的过表达不仅提高了水稻的抗旱性，而且增强了其对盐和PEG的耐受性。因此，利用基因工程技术，从春兰中克隆获得CgWRKY2基因，该基因在低温胁迫下存在明显的表达差异，因此将CgWRKY2基因转入植物中，极具应用前景。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有育种技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种春兰CgWRKY2基因。本专利技术的另一目的是提供春兰CgWRKY2基因在兰花育种中的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种春兰CgWRKY2基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的春兰CgWRKY2基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述的春兰CgWRKY2基因在植物生产和育种中的应用。含有所述的的春兰CgWRKY2基因的载体。含有所述的春兰CgWRKY2基因的宿主细胞。有益效果：与现有技术相比，本专利技术通过对春兰CgWRKY2基因的克隆与鉴定，基因的表达分析，验证其功能，发现过表达CgWRKY2基因的拟南芥植株生长发育缓慢，植株矮化，并伴有叶片早枯等提前衰老的表型，可见该基因在兰花和其它植物生产、育种中将有广泛的用途。附图说明图1是春兰CgWRKY2基因克隆和构建的过表达载体图；图2a图是CgWRKY2在春兰各组织中的表达情况，其中，R表示根，P表示假鳞茎，L表示叶，F表示花；b图是低温胁迫下春兰CgWRKY2基因的表达情况；图3a图是酶切结果图，其中，M：DL2000Marker；CgWRKY2与pBI121连接后用SmaI和SnabI双酶切；b图是阳性重组子的筛选图，其中，M：DL2000Marker，目的条带大小为2031bp；图4是转基因拟南芥植株PCR结果图，其中，M：DL2000Marker；CK+：以载体质粒DNA为阳性对照；CK-：野生型DNA为阴性对照；水：空白对照；图5是转CgWRKY2基因植株与野生型拟南芥植株株型比较图，图中WT，野生型拟南芥；1-3，转CgWRKY2基因的不同株系；图6是转CgWRKY2基因植株与野生型COL拟南芥叶片比对图；图中WT，野生型拟南芥；1-3，转CgWRKY2基因的不同株系；图7是转CgWRKY2基因植株与野生型拟南芥在低温胁迫下，冷胁迫相关基因表达情况比对图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1本实施例所采用的材料是春兰‘宋梅’叶片，采后速冻于液氮中，超低温冰箱（-80℃）保存。1）春兰叶片总RNA的提取按照TaKaRa植物总RNA提取试剂盒的说明书进行，具体操作为：将超低温冻存的春兰叶片迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；将研磨成粉状的样品加入到含有450μlBufferPE的1.5mL灭菌tube中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀；将裂解液12,000rpm，4℃离心5分钟；将上清液小心吸取到新的1.5mL灭菌tube中。加入上清液1/10体积的BufferNB，Vortex振荡混匀，12,000rpm，4℃离心5钟；将上清液小心吸取到新的1.5mL灭菌tube中，加入450μL的BufferRL，使用移液枪将溶液混合均匀；加入混合液1/2体积的无水乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀后，立即将混合液全部转入到RNASpinColumn中；12,000rpm，离心1分钟，弃滤液，将RNASpinColumn放回到2mlCollectionTube中；将500μL的BufferRWA加入至RNASpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；600μL的BufferRWB加入至RNASpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；向RNASpinColumn膜中央加入50μLDNaseI反应液，室温静置15分钟；向RNASpinColumn膜中央加入350μL的BufferRWB，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；将RNASpinColumn重新安置于2mLCollectionTube上，12,000rpm离心2分钟；将RNASpinColumn安置于1.5mL的RNaseFreeCollectionTube上，在RNASpinColumn膜中央处加入50μL的RNaseFreedH2O室温静置5分钟，12,000rpm离心2分钟洗脱RNA。所得RNA经浓度和纯度检测后存于-80℃冰箱保存备用。吸取2μLRNA利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示28S和18S条带较为清晰，28S条带亮度约为18S的两倍，RNA质量较好。通过微量核算蛋白测定仪检测RNA纯度，OD260/OD280为2.03，OD260/OD230为2.01，完整性较好，可用于反转录。2）第一链cDNA的合成以所得到的的总RNA为模板，使用TaKaRa反转录试剂盒进行反转录，使用Oligo(dT)作为锚定引物，反转录合成第一链cDNA。具体操作如下：在离心管中配制按照下列模板RNA/引物的顺序配制混合物，总量为10μL：模板1μg，Oligo(dT)Primer(50μM)1μL，dNTPMixture(10mMeach)1μL,剩余体积用RNase-freeddH2O补齐。65℃保温5min后，冰上迅速冷却；将该离心管离心，使离心管中的混合物均沉于管底。在新的离心管中配制反转录反应液（20μL）：上述变性后反应液10μL，5×PrimeScriptBuffer4μL，RNaseInhibitor(40U/μl)0.5μL，PrimeScriptRTase(200U/μl)1μL，RNaseFreedH2O补齐20μL。缓慢摇匀，在PCR仪上，30℃保温10min，42℃保温30min，95℃保温5min使酶失活，冰上放置，得到cDNA溶液。3）目的基因引物的设计及克隆根据现有的春兰转录组测序数据，利用其它物种的WRKY相关基因序列进行Blast同源比对。利用Oligo6.0，Prime5.0设计相应引物，引物序列为：C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种春兰

【技术特征摘要】
1.一种春兰CgWRKY2基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的春兰CgWRKY2基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡凤荣，景袭俊，刘倩，王连平，张鸽香，丁彦芬，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32