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一种改善结肠炎的IL-35重组乳酸菌制造技术

技术编号:20884483 阅读:18 留言:0更新日期:2019-04-17 13:30
本发明专利技术公开了重组rIL‑35基因,它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示;携带rIL‑35基因的乳酸菌表达载体,它插入了序列表SEQ ID NO.1所示的基因;携带rIL‑35基因的大肠杆菌‑乳酸菌穿梭表达载体的制备方法,它包括:1)人工合成序列表SEQ ID NO.1所示的基因,上下游加入了Sac II和Sma I酶切位点;2)用Sac II和Sma I酶切步骤1)所述的基因和pW425N;序列表SEQ ID NO.1所示的基因插入pW425N;IL‑35重组乳酸菌,它转化了上述的携带rIL‑35基因的乳酸菌表达载体;IL‑35重组乳酸菌在制备改善或缓解结肠炎药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种改善结肠炎的IL-35重组乳酸菌
本专利技术属生物
,具体涉及一种改善结肠炎的IL-35重组乳酸菌及其制备方法。
技术介绍
溃疡性结肠炎是一种特发性的结肠炎症性疾病,它不同于各种感染性结肠疾病,尽管病变征象有相似之处,但迄今的研究未能发现哪种致病菌是这类肠粘膜炎症的致病原。本病主要以结、直肠粘膜以及粘膜下层发生慢性、非特异性炎症性病变为中心,粘膜上皮及腺体破坏、增生或萎缩,炎性细胞浸润,隐窝脓肿形成,因而呈现粘膜充血、糜烂、溃疡以及增殖性改变。临床表现也体现了炎症性肠病的特点,出现脓血便或粘液血便、里急后重,或伴腹痛、发热等。本病常突发起病,病情轻重悬殊,多数病程缓慢,有反覆发作倾向,少数病例成急性暴发,病情凶险。溃疡性结肠炎是胃肠道最严重的疾病之一,近年来发病率逐渐升高,并且本病与结肠癌的发病也有一定的关系,因此被世界卫生组织列为现代难治病之一。目前本病病因及确切发病机制至今未明,一般认为涉及到遗传、免疫、感染、精神等多方面因素,因此治疗上尚缺乏特异性措施。目前一般认为,炎症性肠病活动期的治疗目标是尽快控制炎症,缓解其临床症状;疾病缓解期则应继续其维持治疗,同时预防疾病复发,并且防治炎症性肠病并发症。对于该病的治疗,目前尚没有特效疗法。临床药物治疗主要有5-氨基水杨酸类制剂、糖皮质激素及免疫抑制和免疫调节剂等。这些治疗药物均存在一些副作用,故限制了其长期使用。因此,研制有效且副作用小的肠道微生态制剂对于预防和治疗结肠炎具有重要实际意义。研究表明,溃疡性结肠炎患者或实验性结肠炎小鼠肠道组织中促炎性Th17细胞比例显著增加,而抑炎性的Treg细胞数量下降。通过降低Th17细胞数量或增加Treg数量能够有效的缓解结肠炎。进一步研究发现,IL-35是Treg细胞分泌的抑炎性细胞因子,能够抑制Th17细胞的分化和增殖,同时IL-35也能促进Treg细胞的增殖。乳酸菌作为人类和动物肠道中的正常菌群,被广泛地认为是安全级的微生物。采用重组DNA技术,构建携带外源基因的乳酸菌表达载体,利用乳酸菌作为宿主菌,实现了功能性蛋白在乳酸菌中的表达,因此重组乳酸菌微生态制剂的研制和应用广为被接受。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种改善结肠炎的IL-35重组乳酸菌及其制备方法。重组rIL-35基因,它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。携带rIL-35基因的乳酸菌表达载体,它插入了序列表SEQIDNO.1所示的基因;所述的乳酸菌表达载体为大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体;所述的大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体为pW425N。携带rIL-35基因的大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体的制备方法,它包括:1)人工合成序列表SEQIDNO.1所示的基因,上下游加入了SacII和SmaI酶切位点;2)用SacII和SmaI酶切步骤1)所述的基因和pW425N;序列表SEQIDNO.1所示的基因插入pW425N。IL-35重组乳酸菌,它转化了上述的携带rIL-35基因的乳酸菌表达载体;所述的乳酸菌为嗜酸乳酸杆菌。IL-35重组乳酸菌在制备改善或缓解结肠炎药物中的应用。本专利技术提供了重组rIL-35基因,它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示;携带rIL-35基因的乳酸菌表达载体,它插入了序列表SEQIDNO.1所示的基因;携带rIL-35基因的大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体的制备方法,它包括:1)人工合成序列表SEQIDNO.1所示的基因,上下游加入了SacII和SmaI酶切位点;2)用SacII和SmaI酶切步骤1)所述的基因和pW425N;序列表SEQIDNO.1所示的基因插入pW425N;IL-35重组乳酸菌,它转化了上述的携带rIL-35基因的乳酸菌表达载体;IL-35重组乳酸菌在制备改善或缓解结肠炎药物中的应用。附图说明图1IL-35重组乳酸菌灌胃后肠道IL-35水平检测结果;图2IL-35重组乳酸菌降低结肠炎小鼠体重损失率检测结果;图3IL-35重组乳酸菌维持结肠炎小鼠结肠长度检测结果;图4IL-35重组乳酸菌缓解结肠炎小鼠肠道组织病理变化检测结果;图5IL-35重组乳酸菌降低结肠炎小鼠肠道中Th17细胞比例检测结果;图6IL-35重组乳酸菌增加结肠炎小鼠肠道中Treg细胞比例检测结果。具体实施方式实施例1IL-35重组乳酸菌的制备IL-35是Ebi3和IL-12ap35亚基组成的异源二聚体蛋白;选择编码Ebi3的23位丙氨酸至228位脯氨酸肽段的基因序列(Ala23-Pro228,621bp),与编码IL-12ap35亚基的23位精氨酸至215位丙氨酸肽段的基因序列(Arg23-Ala215,582bp),用常规的linker蛋白基因(45bp)将二者连接;采用人工合成或PCR技术的方式获得全长为1248bp的重组IL-35基因,命名为rIL-35,基因序列表如SEQID1所示。采用常规分子克隆技术构建携带rIL-35基因的乳酸菌重组表达载体;本实施例中,在rIL-35基因的上下游加入了SacII和SmaI酶切位点,采用pW425N乳酸菌表达载体,最终获得了pW425N/rIL-35;采用但不限于嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillusacidophilus,Lb.acidophilus)为受体菌,通过常规的乳酸菌电转化技术获得了分泌rIL-35的重组嗜酸乳酸杆菌,命名为Lb.acidophilus/rIL-35。实施例2IL-35重组乳酸菌增加小鼠肠道IL-35水平将20只6-8周龄的C57BL/6J小鼠随机分成4组,每组10只(雌雄各半)。分别为PBS组、Lb.acidophilus组(空菌组)、Lb.acidophilus/pW425N组(空载体组)、Lb.acidophilus/rIL-35组和热灭活的Lb.acidophilus/rIL-35组(Lb.acidophilus/rIL-35i)。PBS组以0.2mlPBS灌胃,其他组以0.2ml菌液灌胃。除PBS组外,菌体数量为每次109cfu/ml。每周灌胃3次,连续灌胃3周后,每7天采样1次,记录为7d、14d和21d。采样部位为结肠组织,采用IL-35ELISA试剂盒,按照说明操作,检测结肠组织中IL-35的水平。结果如图1所示,在相同采样时间内,Lb.acidophilus/rIL-35组小鼠结肠组织的IL-35水平显著高于其他组,且随着采样时间的增加呈现显著上升趋势,而热灭活的Lb.acidophilus/rIL-35并不能显著增加小鼠结肠组织的IL-35水平。结果表明,IL-35重组乳酸菌增加了小鼠结肠组织的IL-35水平。实施例3IL-35重组乳酸菌缓解实验性结肠炎小鼠实验性结肠炎采用经典的DSS诱导法。采用3%DSS自由饮水造模,并将小鼠分为以下实验组:正常饮水组(Ctr)、3%DSS组、3%DSS+Lb.acidophilus/pW425N组、3%DSS+Lb.acidophilus/rIL-35组、3%DSS+Lb.acidophilus/rIL-35i组、3%DSS+IL35组(尾静脉注射IL-35蛋白3μg/只/天)。造模期间,每天称量小鼠体重并计算体重损失率,采用便隐血试剂盒,按照说明操作评价小鼠便隐血情况,每天观察小鼠腹泻情况本文档来自技高网
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【技术保护点】
1. 重组rIL‑35基因,它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.重组rIL-35基因,它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。2.携带rIL-35基因的乳酸菌表达载体,它插入了序列表SEQIDNO.1所示的基因。3.根据权利要求2所述的携带rIL-35基因的乳酸菌表达载体,其特征在于:所述的乳酸菌表达载体为大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体。4.根据权利要求3所述的携带rIL-35基因的乳酸菌表达载体,其特征在于:所述的大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体为pW425N。5.携带rIL-35基因的大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员:郝凤奇田苗苗王建勇李景梅
申请(专利权)人:郝凤奇
类型:发明
国别省市:吉林,22

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