一种特异性识别组胺的寡核苷酸适配体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性识别组胺的寡核苷酸适配体，所述适配体HIM‑3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；将适配体的5’端或3’端标记FAM、琉基基团、FITC、生物素中的一种或多种，用于小分子组胺的分析检测。本发明专利技术适配体可在体外筛选，筛选周期短，合成方便，易标记各种功能基团和报告分子，性质稳定，可长期保存使用。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性识别组胺的寡核苷酸适配体及其应用
本专利技术涉及食品安全生物
，尤其是涉及一种利用分子生物学技术中的SELEX技术，选出一种能特异性识别小分子化合物组胺的寡核苷酸适配体，为该核酸适配体在检测食品中组胺的应用提供科学依据和理论基础。
技术介绍
生物胺是一类是由醛和酮氨基化或氨基酸脱羧形成的一类低分子含氮有机物。生物胺种类较多，包括腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺、组胺、色胺等。目前就食品安全问题中出现的生物胺对人体的毒性作用，组胺的影响最大，毒性最强。服用组胺8-40mg出现轻微中毒症状，超过40mg出现中等中毒症状，超过100mg出现严重中毒症状。组胺常出现在肉制品、发酵制品尤其是水产品中。许多国家对组胺都有一定的限量标准如GB2733-2015《鲜(冻)动物性水产品卫生标准》规定高组胺鱼类(鲐鱼、鲹鱼、竹荚鱼、鲸鱼、鲣鱼、金枪鱼、秋刀鱼、马鲛鱼、青占鱼、沙丁鱼等青皮红肉海水鱼)组胺含量应低于40mg/100g，其它海水鱼类应低于20mg/100g。对于水产加工制品，GB7098-2015《食品安全国家标准罐头食品》规定鱼类制品(仅适用于鲐鱼、鲹鱼、沙丁鱼罐头)组胺不得超过100mg/100g。此外，国外的一些规定如美国食品及药物管理局规定水产品中组胺量须小于50mg/kg，其它食品中组胺量须小于500mg/kg；欧盟规定鱼类中组胺量须小于100mg/kg，发酵的鱼露产品组胺量须小于400mg/kg。因此为保障食品安全，公众健康，建立一种简单、灵敏、廉价、精确检测食品中组胺的检测方法至关重要。因此对食品中组胺的检测与控制非常重要，传统的检测方法包括色谱法如薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱、离子色谱，毛细管电泳法等。但这些方法都有一定的缺陷，如样品的前处理复杂耗时、仪器昂贵、携带不便、难以实现现场快速检测，灵敏度低等。因此发展一种能快速、可靠检测食品中组胺的方法极其重要。而新兴的以识别元件为核心的生物传感器法，如酶生物传感器法、免疫生物传感器法、分子印迹膜生物传感器法虽提高了其灵敏度，但识别分子稳定性差、制备困难、寻找合适的功能单体和模板分子洗脱溶剂的过程费时费力。适配体是利用指数富集的配基系统进化技术(SELEX)从体外合成的随机核苷酸序列文库中筛选获得能够特异性识别结合靶标的一段短的单链脱氧核糖核苷酸(ssDNA)或核糖核苷酸(RNA)序列，具有靶分子范围广、高亲和力和高特异性、筛选周期短的显著特点，与抗体相比合成方便，成本低，易标记各种功能基团，不易受温度等环境因素影响，可以在长期保存过程保持很好的稳定性。这些独特优势使适配体在化学分析、医药和食品安全等领域具有广阔的应用前景。Capture-SELEX是一种基于靶标为游离的小分子，而文库固定在特定的载体上的筛选方法，通过分离收集悬浮液从而将结合和未结合的寡核苷酸分子分离的技术。近几年，已成功采用Capture-SELEX技术筛选出盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、卡那霉素A、镉离子、青霉素G等的适配体，基于Capture-SELEX技术筛选小分子毒素的适配体已经成为当前的研究热点。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种特异性识别组胺的寡核苷酸适配体。本专利技术适配体能特异性识别组胺，具有稳定性高、合成方便、易标记功能基团等特点，可广泛应用于食品中组胺的快速检测。本专利技术的技术方案如下：一种特异性识别组胺的寡核苷酸适配体，所述适配体HIM-3的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。一种特异性识别组胺的寡核苷酸适配体的应用，用于小分子组胺的分析检测。一种特异性识别组胺的寡核苷酸适配体的应用，将适配体的5’端或3’端标记FAM、琉基基团、FITC、生物素中的一种或多种，用于小分子组胺的分析检测。本专利技术有益的技术效果在于：本专利技术适配体可在体外筛选，筛选周期短，合成方便，易标记各种功能基团和报告分子，性质稳定，可长期保存使用。本专利技术适配体是亲和力、特异性、pH稳定性均相对较强的适配体序列，能够特异识别组胺分子。本专利技术可以构建以适配体为分子识别探针的检测技术，能够更灵敏地检测出食品中存在的组胺。附图说明图1为基于Capture-SELEX技术筛选出小分子化合物组胺核酸适配体的示意图。图2为适配体HIM-1、HIM-3、HIM-5、HIM-6亲和力饱和结合曲线；图3为适配体HIM-1、HIM-3、HIM-5、HIM-6的特异性图谱；图4为适配体HIM-1、HIM-3、HIM-5、HIM-6在不同pH条件下稳定性分析图谱；图5为Mfold软件预测HIM-3的二级结构图谱；图6为基于适配体HIM-3识别比色法检测组胺的标准曲线；具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术进行具体描述。实施例1：适配体的筛选图1为利用Capture-SELEX筛选能特异性识别组胺的适配体的流程图，具体包括如下步骤：(1)文库杂交：设计一段与文库引物区部分碱基互补并进行生物素标记的互补链CO，将ssDNA文库与互补链CO杂交互补；(2)文库固定：利用互补链CO上标记的生物素和磁珠上的链霉亲和素特异性结合将ssDNA文库固定在磁珠表面，并多次清洗去除非特异性结合的ssDNA；(3)反筛孵育：筛选过程中，在第4、7、9、12、14、15、16、17轮中首先将组胺的结构类似物色胺、酪胺、苯乙胺、盐酸多巴胺、L-组氨酸、L-色氨酸与固定化文库预先孵育结合以提高适配体的特异性。(4)磁分离：在外加磁力的作用下分离去除上清液即含有与反筛物质结合的ssDNA，保留未结合的磁珠文库；(5)正筛孵育：将清洗后的磁珠文库与靶标组胺进行孵育结合；孵育过程中ssDNA与靶标结合时会由原先单链状态折叠成三维空间结构，ssDNA结构的变化使其与互补链CO配对的碱基间的氢键断裂，导致ssDNA从磁珠上解离至溶液中，而不与靶标结合或结合较弱ssDNA依然与互补链CO碱基配对连接在磁珠上；(6)磁分离：在外加磁力的作用下去除未与组胺结合的磁珠文库，保留上清液即含有与靶标结合的ssDNA；(7)PCR扩增：以上清液中ssDNA-靶标为模板进行PCR扩增；(8)酶切：利用Lamda外切酶将PCR产物的双链DNA(dsDNA)酶切为ssDNA，以获得下一轮筛选的ssDNA次级文库。另外，在筛选过程中，为提高适配体的亲和性、特异性，除加入反筛步骤还通过改变一些其他实验条件来增加筛选压力。如随筛选轮数的增大，ssDNA文库与组胺的摩尔浓度比从1:180增大到1:50；正筛孵育时间从120min降低到30min等。重复循环以上筛选步骤，利用每一轮相对荧光强度的变化监测筛选进程，根据荧光监测结果将第16轮筛选得到的产物进行PCR扩增，用于克隆测序。实施例2：克隆测序克隆测序共得到39条适配体序列。采用DNAMAN，Mfold软件分析，根据其一级结构，二级结构等将其分为7个家族，从每个家族中挑选出具有代表性的序列，共挑出8条候选适配体用于特性分析。8条序列分别标记为HIM-1、HIM-2、HIM-3、HIM-4、HIM-5、HIM-6、HIM-7、HIM-8。实施例3：亲和性分析合成上述8条候选适配体其5’端进行生物素化标记，用TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mMEDTA,PH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性识别组胺的寡核苷酸适配体，其特征在于，所述适配体HIM‑3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种特异性识别组胺的寡核苷酸适配体，其特征在于，所述适配体HIM-3的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种权利要求1所述特异性识别组胺的寡核苷酸适配体的应用，其特征在于，用于小分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：段诺，朱肖音，吴世嘉，王周平，齐硕，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32